https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?action=history&feed=atom&title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofihRazvoj novih genskih orodij v metanotrofih - Revision history2026-05-30T05:17:16ZRevision history for this page on the wikiMediaWiki 1.45.3https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih&diff=23896&oldid=prevJan Pistotnik at 07:27, 29 May 20242024-05-29T07:27:30Z<p></p>
<table style="background-color: #fff; color: #202122;" data-mw="interface">
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<tr class="diff-title" lang="en">
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">← Older revision</td>
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">Revision as of 07:27, 29 May 2024</td>
</tr><tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l38">Line 38:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 38:</td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>V ''M. capsulatus'' Bath se plazmid pCAH01 pomnožuje najslabše (11 ± 1), temu sledijo plazmidi pBMTL-2 (56 ± 10) in pQCH (74 ± 10). Vsi plazmidi so se bolje pomnoževali v M. trichosporium, je pa relativni trend pomnoževanja v obeh organizmih podoben: v ''M. trichosporium'' se je najslabše pomnoževal pCAH01 (125 ± 78) nato pBMTL-2 (198 ± 140) in najbolje pQCH (401 ± 239). Opazili so, da je visoko število kopij pQCH v transformantah ''M. trichosporium'' bila povezana z daljšim obdobjem razvoja kolonij (1 mesec pri pQCH transformantah in 1 teden pri transformantah ostalih plazmidov). Višje število plazmidov v ''M. trichosporium'' je bilo nepričakovano, saj netransformirana bakterija sama po sebi že vsebuje tri plazmide. Ti plazmidi pojasnijo tudi visoko relativno varianco med rezultati števila plazmidov M. trichosporium in M. capsulatus Bath, sklepajo namreč, da je stabilnost ohranitve teh plazmidov v M. trichosporium zaradi tekmovanja s prisotnimi plazmidi nižja. Sklepa se, da se druge plazmide istih kompatibilnostnih skupin vzdržuje na podobni ravni.</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>V ''M. capsulatus'' Bath se plazmid pCAH01 pomnožuje najslabše (11 ± 1), temu sledijo plazmidi pBMTL-2 (56 ± 10) in pQCH (74 ± 10). Vsi plazmidi so se bolje pomnoževali v M. trichosporium, je pa relativni trend pomnoževanja v obeh organizmih podoben: v ''M. trichosporium'' se je najslabše pomnoževal pCAH01 (125 ± 78) nato pBMTL-2 (198 ± 140) in najbolje pQCH (401 ± 239). Opazili so, da je visoko število kopij pQCH v transformantah ''M. trichosporium'' bila povezana z daljšim obdobjem razvoja kolonij (1 mesec pri pQCH transformantah in 1 teden pri transformantah ostalih plazmidov). Višje število plazmidov v ''M. trichosporium'' je bilo nepričakovano, saj netransformirana bakterija sama po sebi že vsebuje tri plazmide. Ti plazmidi pojasnijo tudi visoko relativno varianco med rezultati števila plazmidov M. trichosporium in M. capsulatus Bath, sklepajo namreč, da je stabilnost ohranitve teh plazmidov v M. trichosporium zaradi tekmovanja s prisotnimi plazmidi nižja. Sklepa se, da se druge plazmide istih kompatibilnostnih skupin vzdržuje na podobni ravni.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker" data-marker="−"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #ffe49c; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Konsenzusni promotor je imel najvišjo aktivnost tako v ''M. capsulatus'' Bath kot tudi v ''M. trichosporium''. Od vseh mutiranih promotorjev je na najvišjo aktivnost v obeh metanotrofih kazal BBa_J23104, kar velja tudi za ''E. coli''. Glede na ''E.coli'' imajo vsi promotorji knjižnice za 4 do 16 krat znižano aktivnost v M. capsulatus in od 20 do 40 krat znižano aktivnost v ''M. trichosporium'', kar je skladno z razlikami v promotorskih elementih med razredoma Gammaproteobacteria in <del style="font-weight: bold; text-decoration: none;">ALphaproteobacteria</del>. Regresijska analiza je pokazala močno povezavo med relativno aktivnostjo promotorjev v ''E.coli'' ter ''M. capsulatus'' (0,74) in ''M. trichosporium'' (0,85). Da ti promotorji v različnih organizmih ohranjajo svojo relativno aktivnost dokazuje tudi predhodna raziskava na metanotrofu ''Methylotucimicrobium buryatense'', ki je z določenimi elementi iste zbirke prišla do enakih rezultatov. Tako lahko to serijo promotorjev na BHR plazmidih uporabljamo kot serijo različno močnih promotorjev, katerih relativno aktivnost med seboj poznamo in jih lahko vnašamo tudi v filogenetsko dalje oddaljene mikroorganizme.</div></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Konsenzusni promotor je imel najvišjo aktivnost tako v ''M. capsulatus'' Bath kot tudi v ''M. trichosporium''. Od vseh mutiranih promotorjev je na najvišjo aktivnost v obeh metanotrofih kazal BBa_J23104, kar velja tudi za ''E. coli''. Glede na ''E.coli'' imajo vsi promotorji knjižnice za 4 do 16 krat znižano aktivnost v M. capsulatus in od 20 do 40 krat znižano aktivnost v ''M. trichosporium'', kar je skladno z razlikami v promotorskih elementih med razredoma Gammaproteobacteria in <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">Alphaproteobacteria</ins>. Regresijska analiza je pokazala močno povezavo med relativno aktivnostjo promotorjev v ''E.coli'' ter ''M. capsulatus'' (0,74) in ''M. trichosporium'' (0,85). Da ti promotorji v različnih organizmih ohranjajo svojo relativno aktivnost dokazuje tudi predhodna raziskava na metanotrofu ''Methylotucimicrobium buryatense'', ki je z določenimi elementi iste zbirke prišla do enakih rezultatov. Tako lahko to serijo promotorjev na BHR plazmidih uporabljamo kot serijo različno močnih promotorjev, katerih relativno aktivnost med seboj poznamo in jih lahko vnašamo tudi v filogenetsko dalje oddaljene mikroorganizme.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Ker so v prejšnjem delu raziskave dokazali podobnost med aktivnostjo promotorja v ''E. coli'' in metanotrofih in ker je iz prejšnkih raziskav bilo znano, da je Ppmoc2 aktiven tudi v ''E. coli'', so se odločili, da bodo aktivnost mutant tega promotorja spremljali v ''E. coli''. Mutante promotorjev so lahko po ekspresiji GFP preko fluorimetričnih metod ločili v mutante z visoko, srednjo in nizko aktivnostjo. Transformante ''E. coli'' s promotorjem z visoko aktivnostjo, so imele vidno manjše kolonije, od tistih s promotorjem z srednjo, nizko ali brez aktivnosti, kar kaže na to, da celično breme predstavlja le močna ekspresija. Sekvenciranje mutant je pokazalo, da imajo le nekatere mutante mutacije c regijah -35 in -10, ne pa vse. Edina mutanta izven promotorske regije, ki je imela učinek na ekspresijo je bila mutanta v start kodonu GFP-ja, kar kaže na to, da za ekspresijo ni pomembnih genskih elementov izven glavne promotorske regije. Da bi preverili primerljivost promotorjev v ''E. coli'' in metanotrofih, so plazmida s danimi promotorji: dva z nizko (P16, -35T v C in -9C v A; P6, -35T v A), enega s srednjo (P8, -31C v T in -3C v T) in dva z visoko ekspresijo (P11 -43G v A; P14 -43G v T), transformirali v ''M. capsulatus''. Podobno kot pri ''E. coli'' so transformante s promotorjem za visoko ekspresijo dale manjše kolonije. V teh so odkrili tudi kolonije brez ekspresije GFP, katerih promotorje so sekvencirali in odkrili mutacijo v start kodonu GFP. Kaže, da gre za mehanizem celice, ki, da bi zmanjšala celično breme, lahko sama mutira start kodone določenih genov. P6, P8 in P16 mutante kažejo na bistveno nižjo aktivnost od promotorja divjega tipa, iz česar lahko sklepamo, da mutante c -35 in -10 regijah bistveno vplivajo na iniciacijo transkripcije RNA. </div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Ker so v prejšnjem delu raziskave dokazali podobnost med aktivnostjo promotorja v ''E. coli'' in metanotrofih in ker je iz prejšnkih raziskav bilo znano, da je Ppmoc2 aktiven tudi v ''E. coli'', so se odločili, da bodo aktivnost mutant tega promotorja spremljali v ''E. coli''. Mutante promotorjev so lahko po ekspresiji GFP preko fluorimetričnih metod ločili v mutante z visoko, srednjo in nizko aktivnostjo. Transformante ''E. coli'' s promotorjem z visoko aktivnostjo, so imele vidno manjše kolonije, od tistih s promotorjem z srednjo, nizko ali brez aktivnosti, kar kaže na to, da celično breme predstavlja le močna ekspresija. Sekvenciranje mutant je pokazalo, da imajo le nekatere mutante mutacije c regijah -35 in -10, ne pa vse. Edina mutanta izven promotorske regije, ki je imela učinek na ekspresijo je bila mutanta v start kodonu GFP-ja, kar kaže na to, da za ekspresijo ni pomembnih genskih elementov izven glavne promotorske regije. Da bi preverili primerljivost promotorjev v ''E. coli'' in metanotrofih, so plazmida s danimi promotorji: dva z nizko (P16, -35T v C in -9C v A; P6, -35T v A), enega s srednjo (P8, -31C v T in -3C v T) in dva z visoko ekspresijo (P11 -43G v A; P14 -43G v T), transformirali v ''M. capsulatus''. Podobno kot pri ''E. coli'' so transformante s promotorjem za visoko ekspresijo dale manjše kolonije. V teh so odkrili tudi kolonije brez ekspresije GFP, katerih promotorje so sekvencirali in odkrili mutacijo v start kodonu GFP. Kaže, da gre za mehanizem celice, ki, da bi zmanjšala celično breme, lahko sama mutira start kodone določenih genov. P6, P8 in P16 mutante kažejo na bistveno nižjo aktivnost od promotorja divjega tipa, iz česar lahko sklepamo, da mutante c -35 in -10 regijah bistveno vplivajo na iniciacijo transkripcije RNA. </div></td></tr>
</table>Jan Pistotnikhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih&diff=23895&oldid=prevJan Pistotnik at 20:16, 28 May 20242024-05-28T20:16:20Z<p></p>
<table style="background-color: #fff; color: #202122;" data-mw="interface">
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<tr class="diff-title" lang="en">
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">← Older revision</td>
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">Revision as of 20:16, 28 May 2024</td>
</tr><tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l14">Line 14:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 14:</td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Trenutno igrajo pomembno vlogo v raziskovanju prisotnih in potencialnih genetskih elementov metanotrofov BHR plazmidi. Za metanotrofe pomembne BHR plazmide lahko razdelimo v dva tipa: replikativni plazmidi se pomnožujejo v metanotrofih. Za ''M. capsulatus Bath'' in ''M. trichosporium'' so raziskovalci razvili več različnih replikativnih plazmidov inkompatibilnostnih skupin P in Q [1]. Poleg replikativnih plazmidov pomembno vlogo igrajo tudi tako imenovani samomorilski (»suicide«) plazmidi. Ti se v metanotrofu ne pomnožujejo, njihova relativna koncentracija pa posledično pada z deljenjem celice. Vloga teh je vnos genskega materiala namenjenega rekombinaciji s kromosomsko DNA. Kljub temu, da se ne pomnožujejo v metanotrofu, pa so zasnovani tako, da se pomnožujejo v ''E. coli'' [1]. </div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Trenutno igrajo pomembno vlogo v raziskovanju prisotnih in potencialnih genetskih elementov metanotrofov BHR plazmidi. Za metanotrofe pomembne BHR plazmide lahko razdelimo v dva tipa: replikativni plazmidi se pomnožujejo v metanotrofih. Za ''M. capsulatus Bath'' in ''M. trichosporium'' so raziskovalci razvili več različnih replikativnih plazmidov inkompatibilnostnih skupin P in Q [1]. Poleg replikativnih plazmidov pomembno vlogo igrajo tudi tako imenovani samomorilski (»suicide«) plazmidi. Ti se v metanotrofu ne pomnožujejo, njihova relativna koncentracija pa posledično pada z deljenjem celice. Vloga teh je vnos genskega materiala namenjenega rekombinaciji s kromosomsko DNA. Kljub temu, da se ne pomnožujejo v metanotrofu, pa so zasnovani tako, da se pomnožujejo v ''E. coli'' [1]. </div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker" data-marker="−"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #ffe49c; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Nativni promotorji, ki so povezani z najbolj izraženimi geni v metanotrofih so promotorji operona pMMO (PpmoC) in od kalcija odvisen promotor operona metanol dehidrogenaze (PmxaF). Izkaže se tudi da pogosto uporabljan promotor Ptac iz ''E. coli'' kaže na podobno aktivnost tem promotorjem ko nadzira izražanje v bakterijskih rodovih ''Methylotuvimicrobium'', ''Methylococcus'' in ''Methylomonas'' [1]. Prav tako v je v nekaterih industrijsko pomembnih metanotrofih bila dokazana funkcionalnost nekaterih inducibilnih promoterjev odvisnih od alosterično reguliranih transkripcijskih faktorjev (TetR, <del style="font-weight: bold; text-decoration: none;">Ara C</del>). Študije delovanja teh promotorjev so omogočile tudi razvoj CRISPR-Cas sistema za določene metanotrofe [1].</div></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Nativni promotorji, ki so povezani z najbolj izraženimi geni v metanotrofih so promotorji operona pMMO (PpmoC) in od kalcija odvisen promotor operona metanol dehidrogenaze (PmxaF). Izkaže se tudi da pogosto uporabljan promotor Ptac iz ''E. coli'' kaže na podobno aktivnost tem promotorjem ko nadzira izražanje v bakterijskih rodovih ''Methylotuvimicrobium'', ''Methylococcus'' in ''Methylomonas'' [1]. Prav tako v je v nekaterih industrijsko pomembnih metanotrofih bila dokazana funkcionalnost nekaterih inducibilnih promoterjev odvisnih od alosterično reguliranih transkripcijskih faktorjev (TetR, <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">AraC</ins>). Študije delovanja teh promotorjev so omogočile tudi razvoj CRISPR-Cas sistema za določene metanotrofe [1].</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>==Raziskava==</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>==Raziskava==</div></td></tr>
</table>Jan Pistotnikhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih&diff=23894&oldid=prevJan Pistotnik at 19:55, 28 May 20242024-05-28T19:55:16Z<p></p>
<table style="background-color: #fff; color: #202122;" data-mw="interface">
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<tr class="diff-title" lang="en">
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">← Older revision</td>
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">Revision as of 19:55, 28 May 2024</td>
</tr><tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l23">Line 23:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 23:</td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• Uporabili plazmid pBBR1RMCS-5 kot matrico za testiranje promotorjev iz Andersonove zbirke promotorjev, da bi dobili promotorje z različno aktivnostjo.</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• Uporabili plazmid pBBR1RMCS-5 kot matrico za testiranje promotorjev iz Andersonove zbirke promotorjev, da bi dobili promotorje z različno aktivnostjo.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker" data-marker="−"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #ffe49c; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• V ''M. capsulatus'' so <del style="font-weight: bold; text-decoration: none;">izvedli mutagenezo </del>pMMO <del style="font-weight: bold; text-decoration: none;">promotorja </del>(Ppmoc2) in izolirali mutante, ki so imele drugačno aktivnost in jih sekvencirali. S tem so proučevali katera mesta so bistvena za vezavo RNA polimeraze hkrati pa pridobili serijo promotorjev za fino uravnavanje sistemov.</div></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• V ''M. capsulatus'' so <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">uvedli pQCHPpmoC2-sfgfp z mutiranimi </ins>pMMO <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">promotorji </ins>(Ppmoc2) in izolirali mutante, ki so imele drugačno aktivnost in jih sekvencirali. S tem so proučevali katera mesta so bistvena za vezavo RNA polimeraze hkrati pa pridobili serijo promotorjev za fino uravnavanje sistemov.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>===Materiali in metode===</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>===Materiali in metode===</div></td></tr>
</table>Jan Pistotnikhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih&diff=23893&oldid=prevJan Pistotnik at 19:45, 28 May 20242024-05-28T19:45:57Z<p></p>
<table style="background-color: #fff; color: #202122;" data-mw="interface">
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<tr class="diff-title" lang="en">
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">← Older revision</td>
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">Revision as of 19:45, 28 May 2024</td>
</tr><tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l21">Line 21:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 21:</td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• Kvantificirali število kopij pogosto uporabljenih replikativnih plazmidov pCAH01 (inkompatibilnostna skupina (Inc) P), pQCH (IncQ) in pBMTL-2, ki je plazmid, ki naj bi se dobro pomnoževal v vseh gram negativnih bakterijah in ima edinstveno inkompatibilnostno skupino pBR1 [10], v obeh organizmih. </div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• Kvantificirali število kopij pogosto uporabljenih replikativnih plazmidov pCAH01 (inkompatibilnostna skupina (Inc) P), pQCH (IncQ) in pBMTL-2, ki je plazmid, ki naj bi se dobro pomnoževal v vseh gram negativnih bakterijah in ima edinstveno inkompatibilnostno skupino pBR1 [10], v obeh organizmih. </div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker" data-marker="−"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #ffe49c; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• Uporabili plazmid <del style="font-weight: bold; text-decoration: none;">pBB1RMCS</del>-5 kot matrico za testiranje promotorjev iz Andersonove zbirke promotorjev, da bi dobili promotorje z različno aktivnostjo.</div></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• Uporabili plazmid <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">pBBR1RMCS</ins>-5 kot matrico za testiranje promotorjev iz Andersonove zbirke promotorjev, da bi dobili promotorje z različno aktivnostjo.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• V ''M. capsulatus'' so izvedli mutagenezo pMMO promotorja (Ppmoc2) in izolirali mutante, ki so imele drugačno aktivnost in jih sekvencirali. S tem so proučevali katera mesta so bistvena za vezavo RNA polimeraze hkrati pa pridobili serijo promotorjev za fino uravnavanje sistemov.</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• V ''M. capsulatus'' so izvedli mutagenezo pMMO promotorja (Ppmoc2) in izolirali mutante, ki so imele drugačno aktivnost in jih sekvencirali. S tem so proučevali katera mesta so bistvena za vezavo RNA polimeraze hkrati pa pridobili serijo promotorjev za fino uravnavanje sistemov.</div></td></tr>
</table>Jan Pistotnikhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih&diff=23892&oldid=prevJan Pistotnik at 19:45, 28 May 20242024-05-28T19:45:24Z<p></p>
<table style="background-color: #fff; color: #202122;" data-mw="interface">
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<tr class="diff-title" lang="en">
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">← Older revision</td>
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">Revision as of 19:45, 28 May 2024</td>
</tr><tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l21">Line 21:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 21:</td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• Kvantificirali število kopij pogosto uporabljenih replikativnih plazmidov pCAH01 (inkompatibilnostna skupina (Inc) P), pQCH (IncQ) in pBMTL-2, ki je plazmid, ki naj bi se dobro pomnoževal v vseh gram negativnih bakterijah in ima edinstveno inkompatibilnostno skupino pBR1 [10], v obeh organizmih. </div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• Kvantificirali število kopij pogosto uporabljenih replikativnih plazmidov pCAH01 (inkompatibilnostna skupina (Inc) P), pQCH (IncQ) in pBMTL-2, ki je plazmid, ki naj bi se dobro pomnoževal v vseh gram negativnih bakterijah in ima edinstveno inkompatibilnostno skupino pBR1 [10], v obeh organizmih. </div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker" data-marker="−"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #ffe49c; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• Uporabili plazmid <del style="font-weight: bold; text-decoration: none;">pBBRMCS1</del>-5 kot matrico za testiranje promotorjev iz Andersonove zbirke promotorjev, da bi dobili promotorje z različno aktivnostjo.</div></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• Uporabili plazmid <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">pBB1RMCS</ins>-5 kot matrico za testiranje promotorjev iz Andersonove zbirke promotorjev, da bi dobili promotorje z različno aktivnostjo.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• V ''M. capsulatus'' so izvedli mutagenezo pMMO promotorja (Ppmoc2) in izolirali mutante, ki so imele drugačno aktivnost in jih sekvencirali. S tem so proučevali katera mesta so bistvena za vezavo RNA polimeraze hkrati pa pridobili serijo promotorjev za fino uravnavanje sistemov.</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>• V ''M. capsulatus'' so izvedli mutagenezo pMMO promotorja (Ppmoc2) in izolirali mutante, ki so imele drugačno aktivnost in jih sekvencirali. S tem so proučevali katera mesta so bistvena za vezavo RNA polimeraze hkrati pa pridobili serijo promotorjev za fino uravnavanje sistemov.</div></td></tr>
</table>Jan Pistotnikhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih&diff=23885&oldid=prevJan Pistotnik at 19:59, 27 May 20242024-05-27T19:59:17Z<p></p>
<table style="background-color: #fff; color: #202122;" data-mw="interface">
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<tr class="diff-title" lang="en">
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">← Older revision</td>
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">Revision as of 19:59, 27 May 2024</td>
</tr><tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l36">Line 36:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 36:</td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>===Rezultati===</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>===Rezultati===</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker" data-marker="−"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #ffe49c; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>V ''M. capsulatus'' Bath se plazmid pCAH01 pomnožuje najslabše (11 ± 1), temu sledijo plazmidi pBMTL-2 (56 ± 10) in pQCH (74 ± 10). Vsi plazmidi so se bolje pomnoževali v M. trichosporium, je pa relativni trend pomnoževanja v obeh organizmih podoben: v ''M. trichosporium'' se je najslabše pomnoževal pCAH01 (125 ± 78) nato pBMTL-2 (198 ± 140) in najbolje pQCH (401 <del style="font-weight: bold; text-decoration: none;">±239</del>). Opazili so, da je visoko število kopij pQCH v transformantah ''M. trichosporium'' bila povezana z daljšim obdobjem razvoja kolonij (1 mesec pri pQCH transformantah in 1 teden pri transformantah ostalih plazmidov). Višje število plazmidov v ''M. trichosporium'' je bilo nepričakovano, saj netransformirana bakterija sama po sebi že vsebuje tri plazmide. Ti plazmidi pojasnijo tudi visoko relativno varianco med rezultati števila plazmidov M. trichosporium in M. capsulatus Bath, sklepajo namreč, da je stabilnost ohranitve teh plazmidov v M. trichosporium zaradi tekmovanja s prisotnimi plazmidi nižja. Sklepa se, da se druge plazmide istih kompatibilnostnih skupin vzdržuje na podobni ravni.</div></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>V ''M. capsulatus'' Bath se plazmid pCAH01 pomnožuje najslabše (11 ± 1), temu sledijo plazmidi pBMTL-2 (56 ± 10) in pQCH (74 ± 10). Vsi plazmidi so se bolje pomnoževali v M. trichosporium, je pa relativni trend pomnoževanja v obeh organizmih podoben: v ''M. trichosporium'' se je najslabše pomnoževal pCAH01 (125 ± 78) nato pBMTL-2 (198 ± 140) in najbolje pQCH (401 <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">± 239</ins>). Opazili so, da je visoko število kopij pQCH v transformantah ''M. trichosporium'' bila povezana z daljšim obdobjem razvoja kolonij (1 mesec pri pQCH transformantah in 1 teden pri transformantah ostalih plazmidov). Višje število plazmidov v ''M. trichosporium'' je bilo nepričakovano, saj netransformirana bakterija sama po sebi že vsebuje tri plazmide. Ti plazmidi pojasnijo tudi visoko relativno varianco med rezultati števila plazmidov M. trichosporium in M. capsulatus Bath, sklepajo namreč, da je stabilnost ohranitve teh plazmidov v M. trichosporium zaradi tekmovanja s prisotnimi plazmidi nižja. Sklepa se, da se druge plazmide istih kompatibilnostnih skupin vzdržuje na podobni ravni.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Konsenzusni promotor je imel najvišjo aktivnost tako v ''M. capsulatus'' Bath kot tudi v ''M. trichosporium''. Od vseh mutiranih promotorjev je na najvišjo aktivnost v obeh metanotrofih kazal BBa_J23104, kar velja tudi za ''E. coli''. Glede na ''E.coli'' imajo vsi promotorji knjižnice za 4 do 16 krat znižano aktivnost v M. capsulatus in od 20 do 40 krat znižano aktivnost v ''M. trichosporium'', kar je skladno z razlikami v promotorskih elementih med razredoma Gammaproteobacteria in ALphaproteobacteria. Regresijska analiza je pokazala močno povezavo med relativno aktivnostjo promotorjev v ''E.coli'' ter ''M. capsulatus'' (0,74) in ''M. trichosporium'' (0,85). Da ti promotorji v različnih organizmih ohranjajo svojo relativno aktivnost dokazuje tudi predhodna raziskava na metanotrofu ''Methylotucimicrobium buryatense'', ki je z določenimi elementi iste zbirke prišla do enakih rezultatov. Tako lahko to serijo promotorjev na BHR plazmidih uporabljamo kot serijo različno močnih promotorjev, katerih relativno aktivnost med seboj poznamo in jih lahko vnašamo tudi v filogenetsko dalje oddaljene mikroorganizme.</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Konsenzusni promotor je imel najvišjo aktivnost tako v ''M. capsulatus'' Bath kot tudi v ''M. trichosporium''. Od vseh mutiranih promotorjev je na najvišjo aktivnost v obeh metanotrofih kazal BBa_J23104, kar velja tudi za ''E. coli''. Glede na ''E.coli'' imajo vsi promotorji knjižnice za 4 do 16 krat znižano aktivnost v M. capsulatus in od 20 do 40 krat znižano aktivnost v ''M. trichosporium'', kar je skladno z razlikami v promotorskih elementih med razredoma Gammaproteobacteria in ALphaproteobacteria. Regresijska analiza je pokazala močno povezavo med relativno aktivnostjo promotorjev v ''E.coli'' ter ''M. capsulatus'' (0,74) in ''M. trichosporium'' (0,85). Da ti promotorji v različnih organizmih ohranjajo svojo relativno aktivnost dokazuje tudi predhodna raziskava na metanotrofu ''Methylotucimicrobium buryatense'', ki je z določenimi elementi iste zbirke prišla do enakih rezultatov. Tako lahko to serijo promotorjev na BHR plazmidih uporabljamo kot serijo različno močnih promotorjev, katerih relativno aktivnost med seboj poznamo in jih lahko vnašamo tudi v filogenetsko dalje oddaljene mikroorganizme.</div></td></tr>
</table>Jan Pistotnikhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih&diff=23884&oldid=prevJan Pistotnik at 19:58, 27 May 20242024-05-27T19:58:42Z<p></p>
<table style="background-color: #fff; color: #202122;" data-mw="interface">
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<tr class="diff-title" lang="en">
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">← Older revision</td>
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">Revision as of 19:58, 27 May 2024</td>
</tr><tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l12">Line 12:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 12:</td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>==Razpoložljiva orodja za manipulacijo metanotrofov==</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>==Razpoložljiva orodja za manipulacijo metanotrofov==</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker" data-marker="−"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #ffe49c; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Trenutno igrajo pomembno vlogo v raziskovanju prisotnih in potencialnih genetskih elementov metanotrofov BHR plazmidi. Za metanotrofe pomembne BHR plazmide lahko razdelimo v dva tipa: replikativni plazmidi se pomnožujejo v metanotrofih. Za ''M. capsulatus Bath'' in ''M. trichosporium'' so raziskovalci razvili več različnih replikativnih plazmidov inkompatibilnostnih skupin P in Q [1]. Poleg replikativnih plazmidov pomembno vlogo igrajo tudi tako imenovani samomorilski (»suicide«) plazmidi. Ti se v metanotrofu ne pomnožujejo, njihova relativna koncentracija pa posledično pada z deljenjem celice. Vloga teh je vnos genskega materiala namenjenega rekombinaciji s kromosomsko DNA. Kljub temu, da se ne pomnožujejo v metanotrofu, pa so <del style="font-weight: bold; text-decoration: none;">skonstruirani </del>tako, da se pomnožujejo v E. coli [1]. </div></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Trenutno igrajo pomembno vlogo v raziskovanju prisotnih in potencialnih genetskih elementov metanotrofov BHR plazmidi. Za metanotrofe pomembne BHR plazmide lahko razdelimo v dva tipa: replikativni plazmidi se pomnožujejo v metanotrofih. Za ''M. capsulatus Bath'' in ''M. trichosporium'' so raziskovalci razvili več različnih replikativnih plazmidov inkompatibilnostnih skupin P in Q [1]. Poleg replikativnih plazmidov pomembno vlogo igrajo tudi tako imenovani samomorilski (»suicide«) plazmidi. Ti se v metanotrofu ne pomnožujejo, njihova relativna koncentracija pa posledično pada z deljenjem celice. Vloga teh je vnos genskega materiala namenjenega rekombinaciji s kromosomsko DNA. Kljub temu, da se ne pomnožujejo v metanotrofu, pa so <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">zasnovani </ins>tako, da se pomnožujejo v <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">''</ins>E. coli<ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">'' </ins>[1]. </div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Nativni promotorji, ki so povezani z najbolj izraženimi geni v metanotrofih so promotorji operona pMMO (PpmoC) in od kalcija odvisen promotor operona metanol dehidrogenaze (PmxaF). Izkaže se tudi da pogosto uporabljan promotor Ptac iz ''E. coli'' kaže na podobno aktivnost tem promotorjem ko nadzira izražanje v bakterijskih rodovih ''Methylotuvimicrobium'', ''Methylococcus'' in ''Methylomonas'' [1]. Prav tako v je v nekaterih industrijsko pomembnih metanotrofih bila dokazana funkcionalnost nekaterih inducibilnih promoterjev odvisnih od alosterično reguliranih transkripcijskih faktorjev (TetR, Ara C). Študije delovanja teh promotorjev so omogočile tudi razvoj CRISPR-Cas sistema za določene metanotrofe [1].</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Nativni promotorji, ki so povezani z najbolj izraženimi geni v metanotrofih so promotorji operona pMMO (PpmoC) in od kalcija odvisen promotor operona metanol dehidrogenaze (PmxaF). Izkaže se tudi da pogosto uporabljan promotor Ptac iz ''E. coli'' kaže na podobno aktivnost tem promotorjem ko nadzira izražanje v bakterijskih rodovih ''Methylotuvimicrobium'', ''Methylococcus'' in ''Methylomonas'' [1]. Prav tako v je v nekaterih industrijsko pomembnih metanotrofih bila dokazana funkcionalnost nekaterih inducibilnih promoterjev odvisnih od alosterično reguliranih transkripcijskih faktorjev (TetR, Ara C). Študije delovanja teh promotorjev so omogočile tudi razvoj CRISPR-Cas sistema za določene metanotrofe [1].</div></td></tr>
</table>Jan Pistotnikhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih&diff=23883&oldid=prevJan Pistotnik at 19:56, 27 May 20242024-05-27T19:56:39Z<p></p>
<table style="background-color: #fff; color: #202122;" data-mw="interface">
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<tr class="diff-title" lang="en">
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">← Older revision</td>
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">Revision as of 19:56, 27 May 2024</td>
</tr><tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l38">Line 38:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 38:</td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>V ''M. capsulatus'' Bath se plazmid pCAH01 pomnožuje najslabše (11 ± 1), temu sledijo plazmidi pBMTL-2 (56 ± 10) in pQCH (74 ± 10). Vsi plazmidi so se bolje pomnoževali v M. trichosporium, je pa relativni trend pomnoževanja v obeh organizmih podoben: v ''M. trichosporium'' se je najslabše pomnoževal pCAH01 (125 ± 78) nato pBMTL-2 (198 ± 140) in najbolje pQCH (401 ±239). Opazili so, da je visoko število kopij pQCH v transformantah ''M. trichosporium'' bila povezana z daljšim obdobjem razvoja kolonij (1 mesec pri pQCH transformantah in 1 teden pri transformantah ostalih plazmidov). Višje število plazmidov v ''M. trichosporium'' je bilo nepričakovano, saj netransformirana bakterija sama po sebi že vsebuje tri plazmide. Ti plazmidi pojasnijo tudi visoko relativno varianco med rezultati števila plazmidov M. trichosporium in M. capsulatus Bath, sklepajo namreč, da je stabilnost ohranitve teh plazmidov v M. trichosporium zaradi tekmovanja s prisotnimi plazmidi nižja. Sklepa se, da se druge plazmide istih kompatibilnostnih skupin vzdržuje na podobni ravni.</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>V ''M. capsulatus'' Bath se plazmid pCAH01 pomnožuje najslabše (11 ± 1), temu sledijo plazmidi pBMTL-2 (56 ± 10) in pQCH (74 ± 10). Vsi plazmidi so se bolje pomnoževali v M. trichosporium, je pa relativni trend pomnoževanja v obeh organizmih podoben: v ''M. trichosporium'' se je najslabše pomnoževal pCAH01 (125 ± 78) nato pBMTL-2 (198 ± 140) in najbolje pQCH (401 ±239). Opazili so, da je visoko število kopij pQCH v transformantah ''M. trichosporium'' bila povezana z daljšim obdobjem razvoja kolonij (1 mesec pri pQCH transformantah in 1 teden pri transformantah ostalih plazmidov). Višje število plazmidov v ''M. trichosporium'' je bilo nepričakovano, saj netransformirana bakterija sama po sebi že vsebuje tri plazmide. Ti plazmidi pojasnijo tudi visoko relativno varianco med rezultati števila plazmidov M. trichosporium in M. capsulatus Bath, sklepajo namreč, da je stabilnost ohranitve teh plazmidov v M. trichosporium zaradi tekmovanja s prisotnimi plazmidi nižja. Sklepa se, da se druge plazmide istih kompatibilnostnih skupin vzdržuje na podobni ravni.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker" data-marker="−"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #ffe49c; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Konsenzusni promotor je imel najvišjo aktivnost tako v ''M. capsulatus <del style="font-weight: bold; text-decoration: none;">Bath</del>'' kot tudi v ''M. trichosporium''. Od vseh mutiranih promotorjev je na najvišjo aktivnost v obeh metanotrofih kazal BBa_J23104, kar velja tudi za ''E. coli''. Glede na ''E.coli'' imajo vsi promotorji knjižnice za 4 do 16 krat znižano aktivnost v M. capsulatus in od 20 do 40 krat znižano aktivnost v ''M. trichosporium'', kar je skladno z razlikami v promotorskih elementih med razredoma Gammaproteobacteria in ALphaproteobacteria. Regresijska analiza je pokazala močno povezavo med relativno aktivnostjo promotorjev v ''E.coli'' ter ''M. capsulatus'' (0,74) in ''M. trichosporium'' (0,85). Da ti promotorji v različnih organizmih ohranjajo svojo relativno aktivnost dokazuje tudi predhodna raziskava na metanotrofu ''Methylotucimicrobium buryatense'', ki je z določenimi elementi iste zbirke prišla do enakih rezultatov. Tako lahko to serijo promotorjev na BHR plazmidih uporabljamo kot serijo različno močnih promotorjev, katerih relativno aktivnost med seboj poznamo in jih lahko vnašamo tudi v filogenetsko dalje oddaljene mikroorganizme.</div></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Konsenzusni promotor je imel najvišjo aktivnost tako v ''M. capsulatus'' <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">Bath </ins>kot tudi v ''M. trichosporium''. Od vseh mutiranih promotorjev je na najvišjo aktivnost v obeh metanotrofih kazal BBa_J23104, kar velja tudi za ''E. coli''. Glede na ''E.coli'' imajo vsi promotorji knjižnice za 4 do 16 krat znižano aktivnost v M. capsulatus in od 20 do 40 krat znižano aktivnost v ''M. trichosporium'', kar je skladno z razlikami v promotorskih elementih med razredoma Gammaproteobacteria in ALphaproteobacteria. Regresijska analiza je pokazala močno povezavo med relativno aktivnostjo promotorjev v ''E.coli'' ter ''M. capsulatus'' (0,74) in ''M. trichosporium'' (0,85). Da ti promotorji v različnih organizmih ohranjajo svojo relativno aktivnost dokazuje tudi predhodna raziskava na metanotrofu ''Methylotucimicrobium buryatense'', ki je z določenimi elementi iste zbirke prišla do enakih rezultatov. Tako lahko to serijo promotorjev na BHR plazmidih uporabljamo kot serijo različno močnih promotorjev, katerih relativno aktivnost med seboj poznamo in jih lahko vnašamo tudi v filogenetsko dalje oddaljene mikroorganizme.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker" data-marker="−"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #ffe49c; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Ker so v prejšnjem delu raziskave dokazali podobnost med aktivnostjo promotorja v ''E. coli'' in metanotrofih in ker je iz prejšnkih raziskav bilo znano, da je Ppmoc2 aktiven tudi v ''E. coli'', so se odločili, da bodo aktivnost mutant tega promotorja spremljali v ''E. coli''. Mutante promotorjev so lahko po ekspresiji GFP preko fluorimetričnih metod ločili v mutante z visoko, srednjo in nizko aktivnostjo. Transformante ''E. coli'' s promotorjem z visoko aktivnostjo, so imele vidno manjše kolonije, od tistih s promotorjem z srednjo, nizko ali brez aktivnosti, kar kaže na to, da celično breme predstavlja le močna ekspresija. Sekvenciranje mutant je pokazalo, da imajo le nekatere mutante mutacije c regijah -35 in -10, ne pa vse. Edina mutanta izven promotorske regije, ki je imela učinek na ekspresijo je bila mutanta v start kodonu GFP-ja, kar kaže na to, da za ekspresijo ni pomembnih genskih elementov izven glavne promotorske regije. Da bi preverili primerljivost promotorjev v ''E. coli'' in metanotrofih, so plazmida s danimi promotorji: dva z nizko (, enega s srednjo in dva z visoko ekspresijo, transformirali v ''M. capsulatus''. Podobno kot pri ''E. coli'' so transformante s promotorjem za visoko ekspresijo dale manjše kolonije. V teh so odkrili tudi kolonije brez ekspresije GFP, katerih promotorje so sekvencirali in odkrili mutacijo v start kodonu GFP. Kaže, da gre za mehanizem celice, ki, da bi zmanjšala celično breme, lahko sama mutira start kodone določenih genov. </div></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Ker so v prejšnjem delu raziskave dokazali podobnost med aktivnostjo promotorja v ''E. coli'' in metanotrofih in ker je iz prejšnkih raziskav bilo znano, da je Ppmoc2 aktiven tudi v ''E. coli'', so se odločili, da bodo aktivnost mutant tega promotorja spremljali v ''E. coli''. Mutante promotorjev so lahko po ekspresiji GFP preko fluorimetričnih metod ločili v mutante z visoko, srednjo in nizko aktivnostjo. Transformante ''E. coli'' s promotorjem z visoko aktivnostjo, so imele vidno manjše kolonije, od tistih s promotorjem z srednjo, nizko ali brez aktivnosti, kar kaže na to, da celično breme predstavlja le močna ekspresija. Sekvenciranje mutant je pokazalo, da imajo le nekatere mutante mutacije c regijah -35 in -10, ne pa vse. Edina mutanta izven promotorske regije, ki je imela učinek na ekspresijo je bila mutanta v start kodonu GFP-ja, kar kaže na to, da za ekspresijo ni pomembnih genskih elementov izven glavne promotorske regije. Da bi preverili primerljivost promotorjev v ''E. coli'' in metanotrofih, so plazmida s danimi promotorji: dva z nizko (<ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">P16, -35T v C in -9C v A; P6, -35T v A)</ins>, enega s srednjo <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">(P8, -31C v T in -3C v T) </ins>in dva z visoko ekspresijo <ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">(P11 -43G v A; P14 -43G v T)</ins>, transformirali v ''M. capsulatus''. Podobno kot pri ''E. coli'' so transformante s promotorjem za visoko ekspresijo dale manjše kolonije. V teh so odkrili tudi kolonije brez ekspresije GFP, katerih promotorje so sekvencirali in odkrili mutacijo v start kodonu GFP. Kaže, da gre za mehanizem celice, ki, da bi zmanjšala celično breme, lahko sama mutira start kodone določenih genov<ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">. P6, P8 in P16 mutante kažejo na bistveno nižjo aktivnost od promotorja divjega tipa, iz česar lahko sklepamo, da mutante c -35 in -10 regijah bistveno vplivajo na iniciacijo transkripcije RNA. </ins></div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div> </div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div><ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">===Povzetek===</ins></div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div><ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">Relativna uspešnost podvojevanja različnih plazmidov v ''M. capsulatus'' in ''M. trichosporium'' je podobna. V ''M. trichosporium'' se izbrani plazmidi pomnožujejo bolje, vendar pa je njihova stabilnost zaradi že prisotnih plazmidov v bakteriji nižja.</ins></div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div> </div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div><ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">Serija promotorjev pridobljenih iz ''E. coli'' iz Andersonove zbirke BBa_J23100-119 ima podobno relativno aktivnost v ''E. coli'' ter ''M. capsulatus'' in ''M. trichosporium''.</ins></div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div> </div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div><ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">Iz mutageneze promotorja Ppmoc2 jim je uspelo pripraviti serijo novih promotorjev z različno ekspresijo</ins>.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>==Viri==</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>==Viri==</div></td></tr>
</table>Jan Pistotnikhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih&diff=23882&oldid=prevJan Pistotnik at 19:38, 27 May 20242024-05-27T19:38:37Z<p></p>
<table style="background-color: #fff; color: #202122;" data-mw="interface">
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<tr class="diff-title" lang="en">
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">← Older revision</td>
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">Revision as of 19:38, 27 May 2024</td>
</tr><tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l40">Line 40:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 40:</td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Konsenzusni promotor je imel najvišjo aktivnost tako v ''M. capsulatus Bath'' kot tudi v ''M. trichosporium''. Od vseh mutiranih promotorjev je na najvišjo aktivnost v obeh metanotrofih kazal BBa_J23104, kar velja tudi za ''E. coli''. Glede na ''E.coli'' imajo vsi promotorji knjižnice za 4 do 16 krat znižano aktivnost v M. capsulatus in od 20 do 40 krat znižano aktivnost v ''M. trichosporium'', kar je skladno z razlikami v promotorskih elementih med razredoma Gammaproteobacteria in ALphaproteobacteria. Regresijska analiza je pokazala močno povezavo med relativno aktivnostjo promotorjev v ''E.coli'' ter ''M. capsulatus'' (0,74) in ''M. trichosporium'' (0,85). Da ti promotorji v različnih organizmih ohranjajo svojo relativno aktivnost dokazuje tudi predhodna raziskava na metanotrofu ''Methylotucimicrobium buryatense'', ki je z določenimi elementi iste zbirke prišla do enakih rezultatov. Tako lahko to serijo promotorjev na BHR plazmidih uporabljamo kot serijo različno močnih promotorjev, katerih relativno aktivnost med seboj poznamo in jih lahko vnašamo tudi v filogenetsko dalje oddaljene mikroorganizme.</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Konsenzusni promotor je imel najvišjo aktivnost tako v ''M. capsulatus Bath'' kot tudi v ''M. trichosporium''. Od vseh mutiranih promotorjev je na najvišjo aktivnost v obeh metanotrofih kazal BBa_J23104, kar velja tudi za ''E. coli''. Glede na ''E.coli'' imajo vsi promotorji knjižnice za 4 do 16 krat znižano aktivnost v M. capsulatus in od 20 do 40 krat znižano aktivnost v ''M. trichosporium'', kar je skladno z razlikami v promotorskih elementih med razredoma Gammaproteobacteria in ALphaproteobacteria. Regresijska analiza je pokazala močno povezavo med relativno aktivnostjo promotorjev v ''E.coli'' ter ''M. capsulatus'' (0,74) in ''M. trichosporium'' (0,85). Da ti promotorji v različnih organizmih ohranjajo svojo relativno aktivnost dokazuje tudi predhodna raziskava na metanotrofu ''Methylotucimicrobium buryatense'', ki je z določenimi elementi iste zbirke prišla do enakih rezultatov. Tako lahko to serijo promotorjev na BHR plazmidih uporabljamo kot serijo različno močnih promotorjev, katerih relativno aktivnost med seboj poznamo in jih lahko vnašamo tudi v filogenetsko dalje oddaljene mikroorganizme.</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker" data-marker="−"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #ffe49c; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Ker so v prejšnjem delu raziskave dokazali podobnost med aktivnostjo promotorja v ''E. coli'' in metanotrofih in ker je iz prejšnkih raziskav bilo znano, da je Ppmoc2 aktiven tudi v ''E. coli'', so se odločili, da bodo aktivnost mutant tega promotorja spremljali v ''E. coli<del style="font-weight: bold; text-decoration: none;">"</del>. Mutante promotorjev so lahko po ekspresiji GFP preko fluorimetričnih metod ločili v mutante z visoko, srednjo in nizko aktivnostjo. Transformante ''E. coli'' s promotorjem z visoko aktivnostjo, so imele vidno manjše kolonije, od tistih s promotorjem z srednjo, nizko ali brez aktivnosti, kar kaže na to, da celično breme predstavlja le močna ekspresija. Sekvenciranje mutant je pokazalo, da imajo le nekatere mutante mutacije c regijah -35 in -10, ne pa vse. Edina mutanta izven promotorske regije, ki je imela učinek na ekspresijo je bila mutanta v start kodonu GFP-ja, kar kaže na to, da za ekspresijo ni pomembnih genskih elementov izven glavne promotorske regije. Da bi preverili primerljivost promotorjev v ''E. coli'' in metanotrofih, so plazmida s danimi promotorji: dva z nizko (, enega s srednjo in dva z visoko ekspresijo, transformirali v ''M. capsulatus''. Podobno kot pri ''E. coli'' so transformante s promotorjem za visoko ekspresijo dale manjše kolonije. V teh so odkrili tudi kolonije brez ekspresije GFP, katerih promotorje so sekvencirali in odkrili mutacijo v start kodonu GFP. Kaže, da gre za mehanizem celice, ki, da bi zmanjšala celično breme, lahko sama mutira start kodone določenih genov. </div></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Ker so v prejšnjem delu raziskave dokazali podobnost med aktivnostjo promotorja v ''E. coli'' in metanotrofih in ker je iz prejšnkih raziskav bilo znano, da je Ppmoc2 aktiven tudi v ''E. coli'', so se odločili, da bodo aktivnost mutant tega promotorja spremljali v ''E. coli<ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">''</ins>. Mutante promotorjev so lahko po ekspresiji GFP preko fluorimetričnih metod ločili v mutante z visoko, srednjo in nizko aktivnostjo. Transformante ''E. coli'' s promotorjem z visoko aktivnostjo, so imele vidno manjše kolonije, od tistih s promotorjem z srednjo, nizko ali brez aktivnosti, kar kaže na to, da celično breme predstavlja le močna ekspresija. Sekvenciranje mutant je pokazalo, da imajo le nekatere mutante mutacije c regijah -35 in -10, ne pa vse. Edina mutanta izven promotorske regije, ki je imela učinek na ekspresijo je bila mutanta v start kodonu GFP-ja, kar kaže na to, da za ekspresijo ni pomembnih genskih elementov izven glavne promotorske regije. Da bi preverili primerljivost promotorjev v ''E. coli'' in metanotrofih, so plazmida s danimi promotorji: dva z nizko (, enega s srednjo in dva z visoko ekspresijo, transformirali v ''M. capsulatus''. Podobno kot pri ''E. coli'' so transformante s promotorjem za visoko ekspresijo dale manjše kolonije. V teh so odkrili tudi kolonije brez ekspresije GFP, katerih promotorje so sekvencirali in odkrili mutacijo v start kodonu GFP. Kaže, da gre za mehanizem celice, ki, da bi zmanjšala celično breme, lahko sama mutira start kodone določenih genov. </div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>==Viri==</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>==Viri==</div></td></tr>
</table>Jan Pistotnikhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih&diff=23881&oldid=prevJan Pistotnik at 19:37, 27 May 20242024-05-27T19:37:55Z<p></p>
<table style="background-color: #fff; color: #202122;" data-mw="interface">
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<col class="diff-marker" />
<col class="diff-content" />
<tr class="diff-title" lang="en">
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">← Older revision</td>
<td colspan="2" style="background-color: #fff; color: #202122; text-align: center;">Revision as of 19:37, 27 May 2024</td>
</tr><tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l1">Line 1:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 1:</td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div><ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">Izhodiščni članek:[https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405805X24000188 Construction of a broad-host-range Anderson promoter series and particulate methane monooxygenase promoter variants expand the methanotroph genetic toolbox]</ins></div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div><ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;"></ins></div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>== Uvod ==</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>== Uvod ==</div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Metan je eden najpomembnejših toplogrednih plinov. Njegov prispevek k povišani temperaturi na račun podnebnih sprememb je okoli 25 odstotkov [1]. Kljub temu gre za molekulo, ki ima velik potencial za biovalorizacijo, gre namreč za molekulo z visokim energijskim potencialom v bioloških sistemih (povprečna ΔG = -103,00 kJ/e- metana za oksidacijo z O2 pri T= 25°C, pH =7 [2]). V bioloških sistemih metan kot edini vir energije porabljajo aerobni ali anaerobni metanotrofi [1],[3],[4]. Metanotrofi so filogenetsko zelo raznolika skupina: predstavnike najdemo v bakterijskih razredih Alphaproteobacteria, Gamaproteobacteria in Verrucomicrobia [5]. Bakterijski predstavniki uporabljajo za končni prejemnik elektrona elektronske transportne verige O2. Poznamo tudi predstavnike v domeni arhej, ki so anaerobni metanotrofi in za končni prejemnik elektronov uporabljajo nitrat, sulfat in še nekatere druge. Metanotrofija se torej nahaja v zelo različnih ekoloških nišah. Pomembno je tudi dejstvo, da imajo različni taksoni z metanotrofi zelo različne anabolne poti. Vse uporabljajo formaldehid, ki nastane kot vmesni produkt oksidacije metana do CO2 kot osnovne gradnike za tvorbo kompleksnejših molekul z več C-atomov. Predstavniki razreda Gamaproteobacteria uporabljajo ribuloza monofosfatni cikel, predstavniki razreda Alphaproteobacteria uporabljajo serinsko pot, predstavniki razreda Verrucomicrobia pa nimajo encimov ne za eno ne za drugo pot, temveč za fiksiranje ogljika uporabljajo Calvinov cikel [5]. Te poti vodijo v različne oblike fiksiranega ogljika: serinska vodi do acetil-CoA, Calvinov in ribuloza monofosfatni cikel pa vodita do gliceraldehid-3- fosfata [5].</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Metan je eden najpomembnejših toplogrednih plinov. Njegov prispevek k povišani temperaturi na račun podnebnih sprememb je okoli 25 odstotkov [1]. Kljub temu gre za molekulo, ki ima velik potencial za biovalorizacijo, gre namreč za molekulo z visokim energijskim potencialom v bioloških sistemih (povprečna ΔG = -103,00 kJ/e- metana za oksidacijo z O2 pri T= 25°C, pH =7 [2]). V bioloških sistemih metan kot edini vir energije porabljajo aerobni ali anaerobni metanotrofi [1],[3],[4]. Metanotrofi so filogenetsko zelo raznolika skupina: predstavnike najdemo v bakterijskih razredih Alphaproteobacteria, Gamaproteobacteria in Verrucomicrobia [5]. Bakterijski predstavniki uporabljajo za končni prejemnik elektrona elektronske transportne verige O2. Poznamo tudi predstavnike v domeni arhej, ki so anaerobni metanotrofi in za končni prejemnik elektronov uporabljajo nitrat, sulfat in še nekatere druge. Metanotrofija se torej nahaja v zelo različnih ekoloških nišah. Pomembno je tudi dejstvo, da imajo različni taksoni z metanotrofi zelo različne anabolne poti. Vse uporabljajo formaldehid, ki nastane kot vmesni produkt oksidacije metana do CO2 kot osnovne gradnike za tvorbo kompleksnejših molekul z več C-atomov. Predstavniki razreda Gamaproteobacteria uporabljajo ribuloza monofosfatni cikel, predstavniki razreda Alphaproteobacteria uporabljajo serinsko pot, predstavniki razreda Verrucomicrobia pa nimajo encimov ne za eno ne za drugo pot, temveč za fiksiranje ogljika uporabljajo Calvinov cikel [5]. Te poti vodijo v različne oblike fiksiranega ogljika: serinska vodi do acetil-CoA, Calvinov in ribuloza monofosfatni cikel pa vodita do gliceraldehid-3- fosfata [5].</div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-lineno" id="mw-diff-left-l37">Line 37:</td>
<td colspan="2" class="diff-lineno">Line 39:</td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Konsenzusni promotor je imel najvišjo aktivnost tako v ''M. capsulatus Bath'' kot tudi v ''M. trichosporium''. Od vseh mutiranih promotorjev je na najvišjo aktivnost v obeh metanotrofih kazal BBa_J23104, kar velja tudi za ''E. coli''. Glede na ''E.coli'' imajo vsi promotorji knjižnice za 4 do 16 krat znižano aktivnost v M. capsulatus in od 20 do 40 krat znižano aktivnost v ''M. trichosporium'', kar je skladno z razlikami v promotorskih elementih med razredoma Gammaproteobacteria in ALphaproteobacteria. Regresijska analiza je pokazala močno povezavo med relativno aktivnostjo promotorjev v ''E.coli'' ter ''M. capsulatus'' (0,74) in ''M. trichosporium'' (0,85). Da ti promotorji v različnih organizmih ohranjajo svojo relativno aktivnost dokazuje tudi predhodna raziskava na metanotrofu ''Methylotucimicrobium buryatense'', ki je z določenimi elementi iste zbirke prišla do enakih rezultatov. Tako lahko to serijo promotorjev na BHR plazmidih uporabljamo kot serijo različno močnih promotorjev, katerih relativno aktivnost med seboj poznamo in jih lahko vnašamo tudi v filogenetsko dalje oddaljene mikroorganizme.</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>Konsenzusni promotor je imel najvišjo aktivnost tako v ''M. capsulatus Bath'' kot tudi v ''M. trichosporium''. Od vseh mutiranih promotorjev je na najvišjo aktivnost v obeh metanotrofih kazal BBa_J23104, kar velja tudi za ''E. coli''. Glede na ''E.coli'' imajo vsi promotorji knjižnice za 4 do 16 krat znižano aktivnost v M. capsulatus in od 20 do 40 krat znižano aktivnost v ''M. trichosporium'', kar je skladno z razlikami v promotorskih elementih med razredoma Gammaproteobacteria in ALphaproteobacteria. Regresijska analiza je pokazala močno povezavo med relativno aktivnostjo promotorjev v ''E.coli'' ter ''M. capsulatus'' (0,74) in ''M. trichosporium'' (0,85). Da ti promotorji v različnih organizmih ohranjajo svojo relativno aktivnost dokazuje tudi predhodna raziskava na metanotrofu ''Methylotucimicrobium buryatense'', ki je z določenimi elementi iste zbirke prišla do enakih rezultatov. Tako lahko to serijo promotorjev na BHR plazmidih uporabljamo kot serijo različno močnih promotorjev, katerih relativno aktivnost med seboj poznamo in jih lahko vnašamo tudi v filogenetsko dalje oddaljene mikroorganizme.</div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div><ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;"></ins></div></td></tr>
<tr><td colspan="2" class="diff-side-deleted"></td><td class="diff-marker" data-marker="+"></td><td style="color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #a3d3ff; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div><ins style="font-weight: bold; text-decoration: none;">Ker so v prejšnjem delu raziskave dokazali podobnost med aktivnostjo promotorja v ''E. coli'' in metanotrofih in ker je iz prejšnkih raziskav bilo znano, da je Ppmoc2 aktiven tudi v ''E. coli'', so se odločili, da bodo aktivnost mutant tega promotorja spremljali v ''E. coli". Mutante promotorjev so lahko po ekspresiji GFP preko fluorimetričnih metod ločili v mutante z visoko, srednjo in nizko aktivnostjo. Transformante ''E. coli'' s promotorjem z visoko aktivnostjo, so imele vidno manjše kolonije, od tistih s promotorjem z srednjo, nizko ali brez aktivnosti, kar kaže na to, da celično breme predstavlja le močna ekspresija. Sekvenciranje mutant je pokazalo, da imajo le nekatere mutante mutacije c regijah -35 in -10, ne pa vse. Edina mutanta izven promotorske regije, ki je imela učinek na ekspresijo je bila mutanta v start kodonu GFP-ja, kar kaže na to, da za ekspresijo ni pomembnih genskih elementov izven glavne promotorske regije. Da bi preverili primerljivost promotorjev v ''E. coli'' in metanotrofih, so plazmida s danimi promotorji: dva z nizko (, enega s srednjo in dva z visoko ekspresijo, transformirali v ''M. capsulatus''. Podobno kot pri ''E. coli'' so transformante s promotorjem za visoko ekspresijo dale manjše kolonije. V teh so odkrili tudi kolonije brez ekspresije GFP, katerih promotorje so sekvencirali in odkrili mutacijo v start kodonu GFP. Kaže, da gre za mehanizem celice, ki, da bi zmanjšala celično breme, lahko sama mutira start kodone določenih genov. </ins></div></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><br></td></tr>
<tr><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>==Viri==</div></td><td class="diff-marker"></td><td style="background-color: #f8f9fa; color: #202122; font-size: 88%; border-style: solid; border-width: 1px 1px 1px 4px; border-radius: 0.33em; border-color: #eaecf0; vertical-align: top; white-space: pre-wrap;"><div>==Viri==</div></td></tr>
</table>Jan Pistotnik