Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi - Revision history

Lsegota: /* Funkcijska analiza promotorjev hsp */

2023-04-11T12:39:31Z

Funkcijska analiza promotorjev hsp

← Older revision		Revision as of 12:39, 11 April 2023
Line 10:		Line 10:

	== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==		== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
	V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi ~~odziva na temperaturo~~ (''tre'').		V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot temperaturno odzivni elementi (''tre'').
	Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].		Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Lsegota at 11:46, 11 April 2023

2023-04-11T11:46:08Z

← Older revision		Revision as of 11:46, 11 April 2023
Line 1:		Line 1:
	Izhodiščni članek :[https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22 Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]		Izhodiščni članek: [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22 Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

Lsegota at 11:45, 11 April 2023

2023-04-11T11:45:48Z

← Older revision		Revision as of 11:45, 11 April 2023
Line 1:		Line 1:
	Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22 :Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]		Izhodiščni članek :[https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22 Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

Lsegota at 11:45, 11 April 2023

2023-04-11T11:45:09Z

← Older revision		Revision as of 11:45, 11 April 2023
Line 1:		Line 1:
	Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]		Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22 :Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

Lsegota: /* Zaključek */

2023-04-11T08:05:08Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 08:05, 11 April 2023
Line 39:		Line 39:
	Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot sta stres za organizem in neselektivna aktivacija genov [1, 3].		Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot sta stres za organizem in neselektivna aktivacija genov [1, 3].

	Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].		Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'', so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

	== Literatura ==		== Literatura ==

Lsegota: /* Zaključek */

2023-04-11T08:04:20Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 08:04, 11 April 2023
Line 37:		Line 37:

	== Zaključek ==		== Zaključek ==
	Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ~~ali~~ neselektivna aktivacija genov [1, 3].		Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot sta stres za organizem in neselektivna aktivacija genov [1, 3].

	Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].		Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

Lsegota: /* Temperaturno pogojena rast N. crasse */

2023-04-11T07:59:47Z

Temperaturno pogojena rast N. crasse

← Older revision		Revision as of 07:59, 11 April 2023
Line 29:		Line 29:
	Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].		Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

	Rezultati so pokazali, da se sev ''~~hsp300~~:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].		Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp30:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

	== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==		== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==

Lsegota: /* Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje */

2023-04-11T07:58:01Z

Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje

← Older revision		Revision as of 07:58, 11 April 2023
Line 23:		Line 23:

	Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.		Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
	Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša ~~konstrukta~~ (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].		Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša promotorja (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

	== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==		== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==

Lsegota: /* Funkcijska analiza promotorjev hsp */

2023-04-11T07:53:39Z

Funkcijska analiza promotorjev hsp

← Older revision		Revision as of 07:53, 11 April 2023
Line 16:		Line 16:

	HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.		HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
	Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem ~~stanjupotreboval~~ pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].		Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanju, potreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

	== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==		== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==

Lsegota: /* Funkcijska analiza promotorjev hsp */

2023-04-11T07:52:05Z

Funkcijska analiza promotorjev hsp

← Older revision		Revision as of 07:52, 11 April 2023
Line 15:		Line 15:
	Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].		Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

	~~''Hsp30''~~ ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.		HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
	Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].		Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].