Retinal Gene Therapy - Revision history

AnaDolinar: /* Virusni vektorji, ki so jih uporabljali v raziskavi */

2014-01-09T16:43:46Z

Virusni vektorji, ki so jih uporabljali v raziskavi

← Older revision		Revision as of 16:43, 9 January 2014
Line 5:		Line 5:
	Sindrom Usher je avtosomna recesivna bolezen, ki prizadane sluh in vid. V nekaterih primerih se pojavi tudi motnja ravnotežja. Podtip bolezni 1B (USH1B) je najpogostejši in ga povzroča okvarjen gen ''MYO7A''. Bolniki se rodijo gluhi, okvare vida pa razvijejo do desetega leta. V raziskavi so preverjali, če je možno slepoto preprečiti z vnosom proteina v okvarjene celice ali mrežnico modelnih miši.		Sindrom Usher je avtosomna recesivna bolezen, ki prizadane sluh in vid. V nekaterih primerih se pojavi tudi motnja ravnotežja. Podtip bolezni 1B (USH1B) je najpogostejši in ga povzroča okvarjen gen ''MYO7A''. Bolniki se rodijo gluhi, okvare vida pa razvijejo do desetega leta. V raziskavi so preverjali, če je možno slepoto preprečiti z vnosom proteina v okvarjene celice ali mrežnico modelnih miši.
	===Virusni vektorji, ki so jih uporabljali v raziskavi===		===Virusni vektorji, ki so jih uporabljali v raziskavi===
	Gen MYO7A oz. njegova cDNA obsega približno 7 kbp in tako presega običajno velikost vključkov, ki so jih do sedaj v celice vnašali z adeno-povezanimi virusi (AAV). Tako so v študiji uporabili enojni vektor AAV (serotipa AAV2 in AAV5) ter sistem dveh vektorjev AAV (AAV2). Pri sistemu dveh vektorjev se celice transducira z dvema AAV, vsak od njih nosi polovico gena. Obe polovici gena imata prekrivajočo regijo, ki je obsegala 1365 baz, kar omogoča združitev obeh koncev DNA v celici.		Gen ''MYO7A'' oz. njegova cDNA obsega približno 7 kbp in tako presega običajno velikost vključkov, ki so jih do sedaj v celice vnašali z adeno-povezanimi virusi (AAV). Tako so v študiji uporabili enojni vektor AAV (serotipa AAV2 in AAV5) ter sistem dveh vektorjev AAV (AAV2). Pri sistemu dveh vektorjev se celice transducira z dvema AAV, vsak od njih nosi polovico gena. Obe polovici gena imata prekrivajočo regijo, ki je obsegala 1365 baz, kar omogoča združitev obeh koncev DNA v celici.

	==Materiali in metode==		==Materiali in metode==
	Eksperimentalno delo je bilo opravljeno na miših Shaker1 (''Myo7a''-null) in celičnih kulturah fotoreceptorskih celic ter epitelijskih pigmentnih celic mrežnice.		Eksperimentalno delo je bilo opravljeno na miših Shaker1 (''Myo7a''-null) in celičnih kulturah fotoreceptorskih celic ter epitelijskih pigmentnih celic mrežnice.

AnaDolinar: /* Korekcija mutantnega fenotipa */

2014-01-09T16:43:24Z

Korekcija mutantnega fenotipa

← Older revision		Revision as of 16:43, 9 January 2014
Line 21:		Line 21:
	Lokalizacijo proteinov so določali v mrežnici miši, ki so jim v oko aplicirali raztopino virusnih delcev (1 x AAV2-MYO7A ali 1 x AAV5-MYO7A). Stopnja izražanja proteina, ki so jo opazili v miših, je bila odvisna od titra virusnih delcev v raztopini. Če je stopnja izražanja previsoka, postane protein za celice strupen in le-te odmrejo.		Lokalizacijo proteinov so določali v mrežnici miši, ki so jim v oko aplicirali raztopino virusnih delcev (1 x AAV2-MYO7A ali 1 x AAV5-MYO7A). Stopnja izražanja proteina, ki so jo opazili v miših, je bila odvisna od titra virusnih delcev v raztopini. Če je stopnja izražanja previsoka, postane protein za celice strupen in le-te odmrejo.
	===Korekcija mutantnega fenotipa===		===Korekcija mutantnega fenotipa===
	Myo7a miši imajo nenormalno razporeditev opsina v fotoreceptorskih celicah, v epitelijskih pigmentnih celicah pa se pojavi odsotnost melanosomov. Vzrok za oba pojava je odsotnost proteina MYO7A, ki sodeluje v celičnem transportu. Fenotip se pri miših, ki so bile tretirane z virusno terapijo, povrne v divji tip. Korekcijo fenotipa so opazili pri obeh enojnih vektorjih, vendar je pri manjšem titru virusov korekcija slabša. Prav tako se fenotip ne popravi daleč stran od mesta injiciranja raztopine. Korekcija je bila opazna tudi še tri mesece po apliciranju virusa.		''Myo7a'' miši imajo nenormalno razporeditev opsina v fotoreceptorskih celicah, v epitelijskih pigmentnih celicah pa se pojavi odsotnost melanosomov. Vzrok za oba pojava je odsotnost proteina MYO7A, ki sodeluje v celičnem transportu. Fenotip se pri miših, ki so bile tretirane z virusno terapijo, povrne v divji tip. Korekcijo fenotipa so opazili pri obeh enojnih vektorjih, vendar je pri manjšem titru virusov korekcija slabša. Prav tako se fenotip ne popravi daleč stran od mesta injiciranja raztopine. Korekcija je bila opazna tudi še tri mesece po apliciranju virusa.

	==Literatura==		==Literatura==
	Lopes, V. S., Boye, S. E., Louie, C. M., Boye, S., Dyka, F., Chiodo, V., Fofo, H., Hauswirth, W. W. in Williams, D. S. Retinal gene Therapy with a large MYO7A cDNA using adeno-associated virus. Gene Therapy, 2013; str. 1-10. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23344065]		Lopes, V. S., Boye, S. E., Louie, C. M., Boye, S., Dyka, F., Chiodo, V., Fofo, H., Hauswirth, W. W. in Williams, D. S. Retinal gene Therapy with a large MYO7A cDNA using adeno-associated virus. Gene Therapy, 2013; str. 1-10. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23344065]

AnaDolinar: /* Rezultati in razprava */

2014-01-09T16:43:11Z

Rezultati in razprava

← Older revision		Revision as of 16:43, 9 January 2014
Line 17:		Line 17:
	==Rezultati in razprava==		==Rezultati in razprava==
	===Izražanje proteina MYO7A v celičnih kulturah===		===Izražanje proteina MYO7A v celičnih kulturah===
	Protein MYO7A so izražali v celični kulturi epitelijskih pigmentnih celic z izbitim genom Myo7a. Kot kontrolo so uporabljali heterozigotne epitelijske pigmentne celice, ki izražajo normalno količino proteina. Pri transdukciji so uporabili enojni vektor AAV2 (1 x AAV2), enojni vektor AAV5 (1 x AAV5) in sistem dveh vektorjev AAV2. Učinkovitost transdukcije je bila pri 1 x AAV2-MYO7A in 1 x AAV5-MYO7A približno enaka. Tudi izražanje proteina in korekcija fenotipa sta bila v obeh primerih podobna. Sistem dveh vektorjev ni bil tako učinkovit, saj se je protein izražal le v manjšem številu celic. Korekcija fenotipa je bila v tem primeru nepopolna. Zaradi tega se bom v nadaljevanju osredotočila na rezultate, ki so jih dobili z uporabo enojnih vektorjev.		Protein MYO7A so izražali v celični kulturi epitelijskih pigmentnih celic z izbitim genom ''Myo7a''. Kot kontrolo so uporabljali heterozigotne epitelijske pigmentne celice, ki izražajo normalno količino proteina. Pri transdukciji so uporabili enojni vektor AAV2 (1 x AAV2), enojni vektor AAV5 (1 x AAV5) in sistem dveh vektorjev AAV2. Učinkovitost transdukcije je bila pri 1 x AAV2-MYO7A in 1 x AAV5-MYO7A približno enaka. Tudi izražanje proteina in korekcija fenotipa sta bila v obeh primerih podobna. Sistem dveh vektorjev ni bil tako učinkovit, saj se je protein izražal le v manjšem številu celic. Korekcija fenotipa je bila v tem primeru nepopolna. Zaradi tega se bom v nadaljevanju osredotočila na rezultate, ki so jih dobili z uporabo enojnih vektorjev.
	===Lokalizacija proteina MYO7A in vivo===		===Lokalizacija proteina MYO7A in vivo===
	Lokalizacijo proteinov so določali v mrežnici miši, ki so jim v oko aplicirali raztopino virusnih delcev (1 x AAV2-MYO7A ali 1 x AAV5-MYO7A). Stopnja izražanja proteina, ki so jo opazili v miših, je bila odvisna od titra virusnih delcev v raztopini. Če je stopnja izražanja previsoka, postane protein za celice strupen in le-te odmrejo.		Lokalizacijo proteinov so določali v mrežnici miši, ki so jim v oko aplicirali raztopino virusnih delcev (1 x AAV2-MYO7A ali 1 x AAV5-MYO7A). Stopnja izražanja proteina, ki so jo opazili v miših, je bila odvisna od titra virusnih delcev v raztopini. Če je stopnja izražanja previsoka, postane protein za celice strupen in le-te odmrejo.

AnaDolinar: New page: =Gensko zdravljenje slepote pri miših z uporabo adeno-povezanih virusov= ==Uvod== ===Sindrom Usher=== Sindrom Usher je avtosomna recesivna bolezen, ki prizadane sluh in vid. V nekaterih ...

2014-01-09T16:40:43Z

New page: =Gensko zdravljenje slepote pri miših z uporabo adeno-povezanih virusov= ==Uvod== ===Sindrom Usher=== Sindrom Usher je avtosomna recesivna bolezen, ki prizadane sluh in vid. V nekaterih ...

New page

=Gensko zdravljenje slepote pri miših z uporabo adeno-povezanih virusov=

==Uvod==
===Sindrom Usher===
Sindrom Usher je avtosomna recesivna bolezen, ki prizadane sluh in vid. V nekaterih primerih se pojavi tudi motnja ravnotežja. Podtip bolezni 1B (USH1B) je najpogostejši in ga povzroča okvarjen gen ''MYO7A''. Bolniki se rodijo gluhi, okvare vida pa razvijejo do desetega leta. V raziskavi so preverjali, če je možno slepoto preprečiti z vnosom proteina v okvarjene celice ali mrežnico modelnih miši.
===Virusni vektorji, ki so jih uporabljali v raziskavi===
Gen MYO7A oz. njegova cDNA obsega približno 7 kbp in tako presega običajno velikost vključkov, ki so jih do sedaj v celice vnašali z adeno-povezanimi virusi (AAV). Tako so v študiji uporabili enojni vektor AAV (serotipa AAV2 in AAV5) ter sistem dveh vektorjev AAV (AAV2). Pri sistemu dveh vektorjev se celice transducira z dvema AAV, vsak od njih nosi polovico gena. Obe polovici gena imata prekrivajočo regijo, ki je obsegala 1365 baz, kar omogoča združitev obeh koncev DNA v celici.
==Materiali in metode==
Eksperimentalno delo je bilo opravljeno na miših Shaker1 (''Myo7a''-null) in celičnih kulturah fotoreceptorskih celic ter epitelijskih pigmentnih celic mrežnice.

Pripravili so tri različne plazmide (plazmid z zapisom za celoten protein, plazmid z zapisom za N-končni del proteina in plazmid z zapisom za C-končni del proteina) in jim določili zaporedje. Pakiranje v virusne delce je potekalo po standardni metodi za produkcijo AAV.

Infekcijo celic v celičnih kulturah so izvedli z inkubacijo celic v mediju, ki je vseboval 10 000 virusnih delcev na celico in 40 µM inhibitorja calpaina (cisteinske proteaze). Tri dni po transdukciji so izvedli liziranje celic in nato prenos western. Na membranah so detektirali proteina MYO7A in aktin. Proteine so ločili tudi na poliakrilamidni gelski elektroforezi v prisotnosti denaturanta. Hkrati so izvedli tudi imunofluorescenčne študije, kjer so protein MYO7A označili z barvilom Alexa-568, jedra pa so pobarvali z barvilom Dapi. Opazovanje je potekalo s konfokalnim mikroskopom.

Raztopino virusnih delcev so aplicirali tudi v oko miši. Uspešnost injiciranja so preverjali z opazovanjem odstopa mrežnice (če je mrežnica odstopila, je to pomenilo uspešno aplikacijo raztopine). Miši so po treh tednih žrtvovali ter pripravili poltanke in ultratanke rezine mrežnice.
Poltanke rezine so barvali s toluidin modrim ter jih kasneje opazovali pod konfokalnim mikroskopom. Pri ultratankih rezinah so najprej detektirali protein s primarnimi protitelesi, te pa s sekundarnimi protitelesi, ki so bila označena z nano zlatom. Opazovanje je potekalo z elektronskim mikroskopom.
==Rezultati in razprava==
===Izražanje proteina MYO7A v celičnih kulturah===
Protein MYO7A so izražali v celični kulturi epitelijskih pigmentnih celic z izbitim genom Myo7a. Kot kontrolo so uporabljali heterozigotne epitelijske pigmentne celice, ki izražajo normalno količino proteina. Pri transdukciji so uporabili enojni vektor AAV2 (1 x AAV2), enojni vektor AAV5 (1 x AAV5) in sistem dveh vektorjev AAV2. Učinkovitost transdukcije je bila pri 1 x AAV2-MYO7A in 1 x AAV5-MYO7A približno enaka. Tudi izražanje proteina in korekcija fenotipa sta bila v obeh primerih podobna. Sistem dveh vektorjev ni bil tako učinkovit, saj se je protein izražal le v manjšem številu celic. Korekcija fenotipa je bila v tem primeru nepopolna. Zaradi tega se bom v nadaljevanju osredotočila na rezultate, ki so jih dobili z uporabo enojnih vektorjev.
===Lokalizacija proteina MYO7A in vivo===
Lokalizacijo proteinov so določali v mrežnici miši, ki so jim v oko aplicirali raztopino virusnih delcev (1 x AAV2-MYO7A ali 1 x AAV5-MYO7A). Stopnja izražanja proteina, ki so jo opazili v miših, je bila odvisna od titra virusnih delcev v raztopini. Če je stopnja izražanja previsoka, postane protein za celice strupen in le-te odmrejo.
===Korekcija mutantnega fenotipa===
Myo7a miši imajo nenormalno razporeditev opsina v fotoreceptorskih celicah, v epitelijskih pigmentnih celicah pa se pojavi odsotnost melanosomov. Vzrok za oba pojava je odsotnost proteina MYO7A, ki sodeluje v celičnem transportu. Fenotip se pri miših, ki so bile tretirane z virusno terapijo, povrne v divji tip. Korekcijo fenotipa so opazili pri obeh enojnih vektorjih, vendar je pri manjšem titru virusov korekcija slabša. Prav tako se fenotip ne popravi daleč stran od mesta injiciranja raztopine. Korekcija je bila opazna tudi še tri mesece po apliciranju virusa.

==Literatura==
Lopes, V. S., Boye, S. E., Louie, C. M., Boye, S., Dyka, F., Chiodo, V., Fofo, H., Hauswirth, W. W. in Williams, D. S. Retinal gene Therapy with a large MYO7A cDNA using adeno-associated virus. Gene Therapy, 2013; str. 1-10. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23344065]