Sintetični - Revision history

Marjeta Milostnik at 20:50, 26 May 2025

2025-05-26T20:50:16Z

← Older revision		Revision as of 20:50, 26 May 2025
Line 32:		Line 32:

	==Zaključek==		==Zaključek==
	V tej študiji so razvili knjižnico ~~skoraj~~ 24 960 sintetičnih nastavljivih promotorjev, ki omogočajo natančno in prilagodljivo uravnavanje večgenske ekspresije v sesalskih celicah. Vsak STP vključuje ~~univerzalno~~ in specifična aktivacijska mesta ~~(UAS in SAS)~~, kar omogoča ortogonalno regulacijo brez medsebojnih vplivov med geni. Eksperimentalna analiza z metodo MPRA je pokazala, da ~~STP-ji~~ omogočajo širok razpon izražanja genov, pri čemer se bazalna aktivnost po aktivaciji z gRNA lahko poveča tudi do 77-krat. Približno 60 % promotorjev se je odzvalo z vsaj enkratnim povečanjem~~, kar potrjuje njihovo nastavljivost~~.~~STP-ji~~ ponujajo zmogljivo orodje za kompleksne sintezno-biološke naloge, kot so uravnavanje posameznih podenot proteinskih kompleksov, ~~dinamična ekspresija~~ transkripcijskih faktorjev ali prilagodljivo izražanje receptorjev. Njihova regulacijska sposobnost izhaja iz raznolikih zaporedij UAS in SAS, kar ustvarja širok dinamični razpon kontrole.		V tej študiji so razvili knjižnico 24 960 sintetičnih nastavljivih promotorjev, ki omogočajo natančno in prilagodljivo uravnavanje večgenske ekspresije v sesalskih celicah. Vsak STP vključuje univerzalna in specifična aktivacijska mesta, kar omogoča ortogonalno regulacijo brez medsebojnih vplivov med geni. Eksperimentalna analiza z metodo MPRA je pokazala, da sintetični nastavljivi prootorji omogočajo širok razpon izražanja genov, pri čemer se bazalna aktivnost po aktivaciji z gRNA lahko poveča tudi do 77-krat. Približno 60 % promotorjev se je odzvalo z vsaj enkratnim povečanjem. Sintetični nastavljivi promotorji ponujajo zmogljivo orodje za kompleksne sintezno-biološke naloge, kot so uravnavanje izražanja posameznih podenot proteinskih kompleksov, dinamično izražanje transkripcijskih faktorjev ali prilagodljivo izražanje receptorjev. Njihova regulacijska sposobnost izhaja iz raznolikih zaporedij UAS in SAS, kar ustvarja širok dinamični razpon kontrole.
	V prihodnosti bi lahko z umetno inteligenco in matematičnim modeliranjem napovedovali delovanje ~~STP-jev~~ in avtomatsko oblikovali večgenske sisteme, prilagojene določenemu okolju. ~~STP-ji~~ tako predstavljajo pomemben korak k bolj precizni, učinkoviti in prilagodljivi genski regulaciji v ~~sintetični~~ biologiji.		V prihodnosti bi lahko z umetno inteligenco in matematičnim modeliranjem napovedovali delovanje sintetičnih nastavljivih promotorjev in avtomatsko oblikovali večgenske sisteme, prilagojene določenemu okolju. Sintetični nastavljivi prootorji tako predstavljajo pomemben korak k bolj precizni, učinkoviti in prilagodljivi genski regulaciji v sintezni biologiji.

	==Viri==		==Viri==

Marjeta Milostnik at 17:15, 25 May 2025

2025-05-25T17:15:59Z

← Older revision		Revision as of 17:15, 25 May 2025
Line 8:		Line 8:

	==Materiali in metode==		==Materiali in metode==
	V študiji so najprej konstruirali knjižnico sintetičnih nastavljivih promotorjev (STP), nato so pripravili CRISPRa in reporterski plazmid, tranficirali celice, izvedli furescenčno mikroskopijo in pretočno citometrijo ter MPRA analizo ter na koncu ~~analizirali vse dobljene podatke~~.		V študiji so najprej konstruirali knjižnico sintetičnih nastavljivih promotorjev (STP), nato so pripravili CRISPRa in reporterski plazmid, tranficirali celice, izvedli furescenčno mikroskopijo in pretočno citometrijo ter MPRA analizo ter na koncu izvedli analizo podatkov z različnimi orodji. Metrične razdalje med zaporedji so izračunali z uporabo Levenshteinove urejevalne razdalje. Za analizo podatkov so uporabili NumPy, pandas in scikit-learn. Izračunali so tudi Pearsonov korelacijski koeficient (PCC) med dvema nizoma podatkov.

	==Rezultati in razprava==		==Rezultati in razprava==
	===Načrtovanje in konstrukcija knjižnice sintetičnih nastavljivih sesalskih promotorjev===		===Načrtovanje in konstrukcija knjižnice sintetičnih nastavljivih sesalskih promotorjev===

Marjeta Milostnik at 17:13, 25 May 2025

2025-05-25T17:13:08Z

← Older revision		Revision as of 17:13, 25 May 2025
Line 4:		Line 4:
	Sintetična biologija omogoča dekodiranje in oblikovanje genetskih sistemov za boljše razumevanje delovanja celic. Natančna, prostorsko in časovno usklajena regulacija izražanja genov je ključna za celične funkcije in prilagodljivost. Pri rekonstrukciji večgenskih sistemov se pogosto uporablja pristop »od spodaj navzgor«, s katerim lahko ustvarimo sisteme za raziskovanje naravnih procesov ali razvoj novih funkcij.		Sintetična biologija omogoča dekodiranje in oblikovanje genetskih sistemov za boljše razumevanje delovanja celic. Natančna, prostorsko in časovno usklajena regulacija izražanja genov je ključna za celične funkcije in prilagodljivost. Pri rekonstrukciji večgenskih sistemov se pogosto uporablja pristop »od spodaj navzgor«, s katerim lahko ustvarimo sisteme za raziskovanje naravnih procesov ali razvoj novih funkcij.
	Cilj predstavljene raziskave v izhodiščnem članku je bil razviti knjižnico sintetičnih nastavljivih promotorjev (STP-jev), ki omogočajo fleksibilno, večnivojsko in neodvisno regulacijo izražanja več genov v sesalskih celicah. Uporabili so metodo MPRA (“massively parallel reporter assays”), ki omogoča natančno kvantifikacijo aktivnosti številnih promotorjev hkrati preko njihovih unikatnih črtnih kod.		Cilj predstavljene raziskave v izhodiščnem članku je bil razviti knjižnico sintetičnih nastavljivih promotorjev (STP-jev), ki omogočajo fleksibilno, večnivojsko in neodvisno regulacijo izražanja več genov v sesalskih celicah. Uporabili so metodo MPRA (“massively parallel reporter assays”), ki omogoča natančno kvantifikacijo aktivnosti številnih promotorjev hkrati preko njihovih unikatnih črtnih kod.
	Obstoječi konstitutivni promotorji niso primerni za dinamično uravnavanje, saj imajo stalno izražanje in ne reagirajo na spremembe v celičnem okolju. Zato so v tej raziskavi uporabili CRISPRa sistem, ki omogoča inducibilno aktivacijo transkripcije s pomočjo neaktivne dCas9, povezane z aktivacijsko domeno in vodene z gRNA.		Obstoječi konstitutivni promotorji niso primerni za dinamično uravnavanje, saj imajo stalno izražanje in ne reagirajo na spremembe v celičnem okolju. Zato so v tej raziskavi uporabili CRISPRa sistem, ki omogoča inducibilno aktivacijo transkripcije s pomočjo neaktivne dCas9, povezane z aktivacijsko domeno (VPR) in vodene z gRNA.
	Razviti sintetični nastavljivi promotorji vsebujejo univerzalna in specifična aktivacijska mesta, kar omogoča natančno in prilagodljivo regulacijo izražanja posameznih genov brez medsebojnega vpliva. V študiji so potrdili njihovo učinkovitost pri enogenski in večgenski ekspresiji ter pokazali, da omogočajo ortogonalno in stopnjevano regulacijo izražanja v sesalskih celicah.		Razviti sintetični nastavljivi promotorji vsebujejo univerzalna in specifična aktivacijska mesta, kar omogoča natančno in prilagodljivo regulacijo izražanja posameznih genov brez medsebojnega vpliva. V študiji so potrdili njihovo učinkovitost pri enogenski in večgenski ekspresiji ter pokazali, da omogočajo ortogonalno in stopnjevano regulacijo izražanja v sesalskih celicah.

	==Materiali in metode==		==Materiali in metode==
			V študiji so najprej konstruirali knjižnico sintetičnih nastavljivih promotorjev (STP), nato so pripravili CRISPRa in reporterski plazmid, tranficirali celice, izvedli furescenčno mikroskopijo in pretočno citometrijo ter MPRA analizo ter na koncu analizirali vse dobljene podatke.

			==Rezultati in razprava==
			===Načrtovanje in konstrukcija knjižnice sintetičnih nastavljivih sesalskih promotorjev===
			Vsak promotor so sestavili iz dveh delov - iz minimalnega promotorja, ki je dolg 39 bp in so ga pridobili iz virusa CMV ter drugega dela, ki je sestavljen iz univerzalnih aktivacijskih mest (UAS) in specifičnih aktivacijskih mest (SAS), kjer se nahajajo tarčna mesta za gRNA. UAS in SAS mesta so dolga 23 bp. Ta mesta so aktivirana s CRISPRa sistemom (dCas9-VPR). Ta dizajn prepreči cross-activation – omogoči neodvisno regulacijo večgenskih sistemov. Tako načrtovanje promotorjev omogoča različne aktivacijske moči promotorjev, ko se različne dCas9-VPR in različne gRNA vežejo na UAS in SAS mesta.
			Sestavili so knjižnico sintetičnih nastavljivih promotorjev (STP) za izražanje gena EGFP. Najprej so gen za luciferazo v plazmidu pNL1.1 zamenjali z genom za EGFP in tako konstruirali plazmid pNGFP, ki je služil kot vektor za testiranje promotorjev. Sintetizirali so dva niza degeneriranih začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje vektorja pNGFP. Dobili so linearne vektorje, ki so jih ciklizirali s homologno rekombinacijo med UAS zaporedji. Nato so izvedli sekvenciranje DNA dobljene knjižnice STP. rezultati so pokazali, da je knjižnica vsebovala 24 960 STP, ki so vsi vsebovali minimalni promotor (minP) in vsaj en element UAS. Dolžine teh zaporedij so bile med 74 in 166 baznih parov. Za oceno raznolikosti promotorjev so izračunali Levenshteinovo razdaljo urejanja in rezultati so nakazovali na prisotnost razločnih strukturnih skupin znotraj knjižnice STP.

	==Rezultati in ~~razprava==~~		===Karakterizacija knjižnice sintetičnih nastavljivih promotorjev===
			Knjižnico sintetičnih nastavljivih promotorjev (STP) so eksperimentalno ovrednotili z metodo MPRA. Pri tem so uporabili človeške embrionalne ledvične celične linije 293T, ki so jih transficirali s STP-knjižnico. Ena skupina celic je bila transficirana zgolj s STP-plazmidi (neaktivirana skupina), druga pa hkrati še s plazmidom pCA_sgUAS, ki je vseboval CRISPRa komponento usmerjeno na UAS zaporedja (aktivirana skupina). Dodatno so uporabili kontrolno skupino, transficirano s praznim vektorjem brez promotorja.
			Za analizo izražanja gena EGFP so uporabili fluorescenčno mikroskopijo in pretočno citometrijo. V kontrolni skupini GFP-pozitivnih celic niso zaznali. V neaktivirani skupini je bil delež GFP-pozitivnih celic približno 2,10 %, medtem ko se je v aktivirani skupini povečal na 6,43 %, kar kaže na uspešno aktivacijo STP-promotorjev.
			Nadalje so izolirali mRNA iz celic ter določili jakost posameznega promotorja z izračunom razmerja med številom prebranih črtnih kod v RNA in DNA zaporedjih. Kvantifikacijo izražanja so izvedli z izračunom spremembe v jakosti promotorja (fold change) pred in po aktivaciji, kar jim je omogočilo oceno nastavljivosti STP-promotorjev.
			Rezultati so pokazali, da ima večina STP-promotorjev nizko bazalno aktivnost, ki pa se ob aktivaciji znatno poveča. Pri nekaterih promotorjih so zaznali celo do 77-kratno povečanje izražanja. Približno 60 % promotorjev se je na aktivacijo odzvalo z vsaj enkratnim povečanjem izražanja (FC > 1), 29 % promotorjev pa je doseglo vsaj 10-kratno povečanje
			Ti rezultati so potrdili, da knjižnica STP vsebuje širok nabor aktivabilnih promotorjev z različno bazalno močjo in različnim razponom aktivacijskih odzivov. Iz tega so zaključili, da STP-knjižnica omogoča natančno, stopenjsko in prilagodljivo regulacijo genskega izražanja, kar je bistveno za napredno uporabo v sintezni biologiji.

	===~~Načrtovanje~~ in ~~konstrukcija knjižnice sintetičnih nastavljivih sesalskih~~ promotorjev===		===Izražanje posameznega gena preko aktivacije STP z usmerjanjem na univerzalna aktivacijska mesta===
			Za potrditev učinkovitosti sintetičnih prilagodljivih promotorjev (STP) pri uravnavanju izražanja posameznega gena so avtorji testirali 20 izbranih STP z različno transkripcijsko jakostjo, izbranih na podlagi MPRA podatkov. Te promotorje so klonirali v posamezne reporterske plazmide in jih transfecirali v celice 293T z ali brez aktivacije s CRISPRa (prek plazmida pCA_sgUAS, usmerjenega na UAS zaporedja). Fluorescenčna mikroskopija in pretočna citometrija sta pokazali različno bazalno izražanje med STP v neaktivirani skupini ter bistveno povečano izražanje GFP v aktivirani skupini. Spremembe v jakosti promotorjev po aktivaciji so bile med 1,2-kratnim in 43,6-kratnim povečanjem, pri čemer je STP1 izkazal največjo prilagodljivost. Analiza korelacije je pokazala dobro ujemanje med rezultati MPRA in eksperimentalnimi meritvami (PCC = 0,73), kar potrjuje zanesljivost MPRA metode. Rezultati dokazujejo, da imajo posamezni STP iz knjižnice različno bazalno in inducirano jakost izražanja, kar omogoča prilagodljivo in CRISPRa-odvisno uravnavanje izražanja posameznih genov.

			===Večnivojska regulacija izražanja posameznega gena v večgenskem sistemu===
			Razvili so tudi tri-genski reporterski sistem s fluorescirajočimi proteini EGFP, mCherry in BFP, da bi preiskusili, ali lahko sintetični nastavljivi promotorji omogočajo večnivojsko in ortogonalno regulacijo izražanja posameznega gena znotraj večgenskih sistemov. Trije promotorji (STP31, STP32, STP33) z različno bazalno jakostjo in specifičnimi SAS mesti so bili uporabljeni za uravnavanje izražanja treh fluorescenčnih proteinov. Vsak gen je bil selektivno aktiviran z usmerjenimi sgRNA molekulami na svoja SAS zaporedja, brez križnega vpliva na izražanje ostalih genov. Postopna in kombinatorna aktivacija SAS mest je omogočila stopenjsko izražanje posameznih genov. STP31-EGFP je dosegel do 41-kratno povečanje ob aktivaciji dveh mest, STP32-mCherry je pokazal do 200-kratno okrepitev ob kombinirani aktivaciji, STP33-BFP, čeprav šibkejši, je dosegel 8-kratno indukcijo.
			Rezultati kažejo, da STP-ji omogočajo natančno, prilagodljivo in ortogonalno regulacijo posameznih genov v kompleksnih genetskih sklopih, kar podpira programabilno in modularno uravnavanje izražanja v večgenskih sistemih.

			===Kombinacijska kontrola nivoja izražanja več genov v večgenskih sistemih===
			Za raziskavo potenciala sintetičnih nastavljivih promotorjev za usklajeno uravnavanje več genov so uporabili reportersko celično linijo, ki izraža proteine EGFP, mCherry in BFP pod nadzorom različnih STP-jev. Izvedli so kombinacijsko aktivacijo z uporabo 2–4 sgRNA, usmerjenih na SAS zaporedja v regijah promotorjev. Izvedli so dvo-gensko (npr. EGFP in mCherry, EGFP in BFP, mCherry in BFP) in tri-gensko (EGFP8, mCherry in BFP) aktivacijo. Prva je pokazala različno, vendar izrazito povečanje izražanja glede na kombinacijo promotorja in sgRNA. Pri STP31 (EGFP) je prišlo do aktivacije od 8- do 38-krat, pri STP32 (mCherry) od 20- do 100-krat in pri STP33 (BFP) do skromne aktivacije (do 7-krat), z omejenim učinkom pri soizražanju s STP31. Tri-genska aktivacija z uporabo treh sgRNA je potrdila močno izražanje EGFP in mCherry, medtem ko je bil porast izražanja BFP le minimalen. Skupaj rezultati kažejo, da lahko kombinacije STP-jev z različnimi aktivnostmi omogočijo neodvisno in prilagodljivo uravnavanje izražanja več genov v enem sistemu, z natančnim ciljanjem promotorjev preko sgRNA.

	==Zaključek==		==Zaključek==
			V tej študiji so razvili knjižnico skoraj 24 960 sintetičnih nastavljivih promotorjev, ki omogočajo natančno in prilagodljivo uravnavanje večgenske ekspresije v sesalskih celicah. Vsak STP vključuje univerzalno in specifična aktivacijska mesta (UAS in SAS), kar omogoča ortogonalno regulacijo brez medsebojnih vplivov med geni. Eksperimentalna analiza z metodo MPRA je pokazala, da STP-ji omogočajo širok razpon izražanja genov, pri čemer se bazalna aktivnost po aktivaciji z gRNA lahko poveča tudi do 77-krat. Približno 60 % promotorjev se je odzvalo z vsaj enkratnim povečanjem, kar potrjuje njihovo nastavljivost.STP-ji ponujajo zmogljivo orodje za kompleksne sintezno-biološke naloge, kot so uravnavanje posameznih podenot proteinskih kompleksov, dinamična ekspresija transkripcijskih faktorjev ali prilagodljivo izražanje receptorjev. Njihova regulacijska sposobnost izhaja iz raznolikih zaporedij UAS in SAS, kar ustvarja širok dinamični razpon kontrole.
			V prihodnosti bi lahko z umetno inteligenco in matematičnim modeliranjem napovedovali delovanje STP-jev in avtomatsko oblikovali večgenske sisteme, prilagojene določenemu okolju. STP-ji tako predstavljajo pomemben korak k bolj precizni, učinkoviti in prilagodljivi genski regulaciji v sintetični biologiji.

	==Viri==		==Viri==
			[1] Zong-Heng Fu, Si Cheng, Jia-Wei Li, Nan Zhang, Yi Wu, Guang-Rong Zhao. Synthetic tunable promoters for flexible control of multi-gene expression in mammalian cells. Journal of Advanced Research. 2025. ISSN 2090-1232. https://doi.org/10.1016/j.jare.2025.02.008
			[2] Costello A, Badran AH. Synthetic Biological Circuits within an Orthogonal Central Dogma. Trends Biotechnol. 2021 Jan;39(1):59-71. doi: 10.1016/j.tibtech.2020.05.013. Epub 2020 Jun 22. PMID: 32586633; PMCID: PMC7746572.
			[3] Hayashi, H., Kubo, Y., Izumida, M. et al. Efficient viral delivery of Cas9 into human safe harbor. Sci Rep 10, 21474 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78450-8

Marjeta Milostnik at 16:30, 25 May 2025

2025-05-25T16:30:32Z

← Older revision		Revision as of 16:30, 25 May 2025
Line 2:		Line 2:

	==Uvod==		==Uvod==
			Sintetična biologija omogoča dekodiranje in oblikovanje genetskih sistemov za boljše razumevanje delovanja celic. Natančna, prostorsko in časovno usklajena regulacija izražanja genov je ključna za celične funkcije in prilagodljivost. Pri rekonstrukciji večgenskih sistemov se pogosto uporablja pristop »od spodaj navzgor«, s katerim lahko ustvarimo sisteme za raziskovanje naravnih procesov ali razvoj novih funkcij.
			Cilj predstavljene raziskave v izhodiščnem članku je bil razviti knjižnico sintetičnih nastavljivih promotorjev (STP-jev), ki omogočajo fleksibilno, večnivojsko in neodvisno regulacijo izražanja več genov v sesalskih celicah. Uporabili so metodo MPRA (“massively parallel reporter assays”), ki omogoča natančno kvantifikacijo aktivnosti številnih promotorjev hkrati preko njihovih unikatnih črtnih kod.
			Obstoječi konstitutivni promotorji niso primerni za dinamično uravnavanje, saj imajo stalno izražanje in ne reagirajo na spremembe v celičnem okolju. Zato so v tej raziskavi uporabili CRISPRa sistem, ki omogoča inducibilno aktivacijo transkripcije s pomočjo neaktivne dCas9, povezane z aktivacijsko domeno in vodene z gRNA.
			Razviti sintetični nastavljivi promotorji vsebujejo univerzalna in specifična aktivacijska mesta, kar omogoča natančno in prilagodljivo regulacijo izražanja posameznih genov brez medsebojnega vpliva. V študiji so potrdili njihovo učinkovitost pri enogenski in večgenski ekspresiji ter pokazali, da omogočajo ortogonalno in stopnjevano regulacijo izražanja v sesalskih celicah.

	==Materiali in metode==		==Materiali in metode==

Marjeta Milostnik at 13:41, 25 May 2025

2025-05-25T13:41:44Z

← Older revision		Revision as of 13:41, 25 May 2025
Line 1:		Line 1:
	Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123225001067?via%3Dihub/ Synthetic tunable promoters for flexible control of multi-gene expression in mammalian cells]		Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123225001067?via%3Dihub/ Synthetic tunable promoters for flexible control of multi-gene expression in mammalian cells]

			==Uvod==


			==Materiali in metode==


			==Rezultati in razprava==

			===Načrtovanje in konstrukcija knjižnice sintetičnih nastavljivih sesalskih promotorjev===



			==Zaključek==


			==Viri==

Marjeta Milostnik at 13:40, 25 May 2025

2025-05-25T13:40:01Z

← Older revision		Revision as of 13:40, 25 May 2025
Line 1:		Line 1:
	Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123225001067?via%3Dihub]		Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123225001067?via%3Dihub/ Synthetic tunable promoters for flexible control of multi-gene expression in mammalian cells]

Marjeta Milostnik at 13:38, 25 May 2025

2025-05-25T13:38:58Z

← Older revision		Revision as of 13:38, 25 May 2025
Line 1:		Line 1:
	Izhodiščni članek:		Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123225001067?via%3Dihub]

Marjeta Milostnik: Created page with "Izhodiščni članek:"

2025-05-25T13:37:54Z

Created page with "Izhodiščni članek:"

New page

Izhodiščni članek: