Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip) - Revision history

Gregor Strniša at 17:40, 24 April 2023

2023-04-24T17:40:04Z

← Older revision		Revision as of 17:40, 24 April 2023
Line 38:		Line 38:
	Lastnosti Tulipa v daljšem časovnem obdobju so opazovali preko gojenja celic z vključkom s Tulipom v turbidostatu. Turbidostat omogoča gojenje celic pri konstantnih pogojih (temperatura, sestava gojišča). Celice so v turbidostatu gojili 48 ur, med katerimi so v dvanajsturnih intervalih spreminjali koncentracijo kuminske kisline v gojišču. Ugotovili so, da do spremembe fluorescence, ki je posledica spremembe koncentracije kuminske kisline, pride v treh do štirih urah. Rast celic je bila skozi celotno časovno obdobje konstantna. Tudi po 50 urah gojenja se je sistem Tulip obdržal v celicah. V kontrolnem poskusu, kjer je gojenje celic potekalo v gojišču brez antibiotika, pa so opazili, da je pri nizkih koncentracijah kuminske kisline prišlo do izgube vključka v bakterijah, zato moramo ob gojenju celic s sistemom Tulip obvezno izvajati selekcijo z antibiotiki [1].		Lastnosti Tulipa v daljšem časovnem obdobju so opazovali preko gojenja celic z vključkom s Tulipom v turbidostatu. Turbidostat omogoča gojenje celic pri konstantnih pogojih (temperatura, sestava gojišča). Celice so v turbidostatu gojili 48 ur, med katerimi so v dvanajsturnih intervalih spreminjali koncentracijo kuminske kisline v gojišču. Ugotovili so, da do spremembe fluorescence, ki je posledica spremembe koncentracije kuminske kisline, pride v treh do štirih urah. Rast celic je bila skozi celotno časovno obdobje konstantna. Tudi po 50 urah gojenja se je sistem Tulip obdržal v celicah. V kontrolnem poskusu, kjer je gojenje celic potekalo v gojišču brez antibiotika, pa so opazili, da je pri nizkih koncentracijah kuminske kisline prišlo do izgube vključka v bakterijah, zato moramo ob gojenju celic s sistemom Tulip obvezno izvajati selekcijo z antibiotiki [1].

	===Uporaba Tulipa===		==Uporaba Tulipa==

	Sistem Tulip omogoča hitrejšo izbiro pravega števila kopij plazmida v celici. Sistem Tulip so vgradili v dva vektorja, ki sta že imela vključena sistema za zaznavanje homoserin laktona (AHL) ali vanilne kisline. Ob prisotnosti liganda je v vsakem sistemu prišlo do transkripcije gena za škrlaten fluorescenčni protein (mScarI). Vsak vektor je imel vključen še zapis za sfGFP pod konstitutivnem promotorju. Oba vektorja so transformirali v bakterijske celice. Ob različnih koncentracijah kuminske kisline in induktorja (AHL ali vanilna kislina) v gojišču so opazovali fluorescenco sfGFP in mScarI. Pri višjih koncentracijah kuminske kisline je prišlo do višje ekspresije mScarI (sorazmerno z dodatkom AHL ali vanilne kisline). Višje izražanje mScarI je negativno vplivalo na izražanje sfGFP pri isti koncentraciji kuminske kisline, kar so pripisali tekmovanju za aminokisline, potrebne za sintezo obeh fluorescenčnih proteinov. Podobne rezultate dobimo tudi pri plazmidih z velikim številom kopij v celici [1].		Sistem Tulip omogoča hitrejšo izbiro pravega števila kopij plazmida v celici. Sistem Tulip so vgradili v dva vektorja, ki sta že imela vključena sistema za zaznavanje homoserin laktona (AHL) ali vanilne kisline. Ob prisotnosti liganda je v vsakem sistemu prišlo do transkripcije gena za škrlaten fluorescenčni protein (mScarI). Vsak vektor je imel vključen še zapis za sfGFP pod konstitutivnem promotorju. Oba vektorja so transformirali v bakterijske celice. Ob različnih koncentracijah kuminske kisline in induktorja (AHL ali vanilna kislina) v gojišču so opazovali fluorescenco sfGFP in mScarI. Pri višjih koncentracijah kuminske kisline je prišlo do višje ekspresije mScarI (sorazmerno z dodatkom AHL ali vanilne kisline). Višje izražanje mScarI je negativno vplivalo na izražanje sfGFP pri isti koncentraciji kuminske kisline, kar so pripisali tekmovanju za aminokisline, potrebne za sintezo obeh fluorescenčnih proteinov. Podobne rezultate dobimo tudi pri plazmidih z velikim številom kopij v celici [1].

Gregor Strniša at 17:28, 24 April 2023

2023-04-24T17:28:16Z

← Older revision		Revision as of 17:28, 24 April 2023
Line 1:		Line 1:
	''Povzeto po članku:[https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13. ]''		''Povzeto po članku: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13. ]''

	==Uvod==		==Uvod==

Gregor Strniša at 17:25, 24 April 2023

2023-04-24T17:25:50Z

← Older revision		Revision as of 17:25, 24 April 2023
Line 49:		Line 49:

	[1] S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.		[1] S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.

	[2] K. Friehs: Plasmid copy number and plasmid stability. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004, 86, 47–82.		[2] K. Friehs: Plasmid copy number and plasmid stability. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004, 86, 47–82.

	[3] D. Manen, L. Caro: The replication of plasmid pSC101. Mol. Microbiol. 1991, 5, 233–237.		[3] D. Manen, L. Caro: The replication of plasmid pSC101. Mol. Microbiol. 1991, 5, 233–237.

	[4] A. Mullick, Y. Xu, R. Warren, M. Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L. Lamoureux, R. Lo, et al.: The cumate gene-switch: A system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol. 2006, 6, 1–18.		[4] A. Mullick, Y. Xu, R. Warren, M. Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L. Lamoureux, R. Lo, et al.: The cumate gene-switch: A system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol. 2006, 6, 1–18.

	[5] D. E. Cameron, J. J. Collins: Tunable protein degradation in bacteria. Nat. Biotechnol. 2014, 32, 1276–1281.		[5] D. E. Cameron, J. J. Collins: Tunable protein degradation in bacteria. Nat. Biotechnol. 2014, 32, 1276–1281.

Gregor Strniša at 17:25, 24 April 2023

2023-04-24T17:25:01Z

@@ Line 5: / Line 5: @@
 ==Razvoj Tulipa==
 ===Plazmid pSC101===
 Delovanje Tulipa temelji na mehanizmu podvojevanja plazmida pSC101. Ta plazmid v svojem zapisu vsebuje gen za protein repA, ki je dolg 316 aminokislin in se lahko v monomerni obliki veže na vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Vezan tvori povezavo z drugimi proteini in spodbudi podvojevanje plazmida. Ob višji koncentraciji v celici protein repA tvori dimere. Kot tak se ne more vezati na vezavno mesto na mestu ori in ne more spodbujati procesa podvojevanje, ampak se veže na lastno regulatorno regijo in inhibira lastno transkripcijo. Zaradi ravnotežja med monomerno in dimerno obliko proteina repA, je število kopij plazmida pSC101 navadno omejeno na 3 kopije na celico [1, 3].
 ===Mutacije v proteinu repA===
 Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].
 V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].

Gregor Strniša at 17:20, 24 April 2023

2023-04-24T17:20:45Z

← Older revision		Revision as of 17:20, 24 April 2023
Line 9:		Line 9:
	===Mutacije v proteinu repA===		===Mutacije v proteinu repA===
	Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].		Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].

	V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].		V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].

Gregor Strniša at 17:20, 24 April 2023

2023-04-24T17:20:34Z

← Older revision		Revision as of 17:20, 24 April 2023
Line 6:		Line 6:
	==Razvoj Tulipa==		==Razvoj Tulipa==
	===Plazmid pSC101===		===Plazmid pSC101===
			Delovanje Tulipa temelji na mehanizmu podvojevanja plazmida pSC101. Ta plazmid v svojem zapisu vsebuje gen za protein repA, ki je dolg 316 aminokislin in se lahko v monomerni obliki veže na vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Vezan tvori povezavo z drugimi proteini in spodbudi podvojevanje plazmida. Ob višji koncentraciji v celici protein repA tvori dimere. Kot tak se ne more vezati na vezavno mesto na mestu ori in ne more spodbujati procesa podvojevanje, ampak se veže na lastno regulatorno regijo in inhibira lastno transkripcijo. Zaradi ravnotežja med monomerno in dimerno obliko proteina repA, je število kopij plazmida pSC101 navadno omejeno na 3 kopije na celico [1, 3].
			===Mutacije v proteinu repA===
			Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].
			V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].

Gregor Strniša at 17:19, 24 April 2023

2023-04-24T17:19:53Z

← Older revision		Revision as of 17:19, 24 April 2023
Line 1:		Line 1:
	''Povzeto po članku:[https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13. ]''		''Povzeto po članku:[https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13. ]''

			==Uvod==
			Ekspresija proteinov obsega več korakov in zahteva poznavanje več sistemov. Da učinkovito izražamo proteine v bakterijskih celicah moramo razumeti potek transkripcije in translacije. Za razliko od različnih možnosti uravnavanja izražanja proteinov na transkripcijskem in translacijskem nivoju, je na regulacijo števila kopij plazmidov v celici težje vplivati. Vsak plazmid ima fiksno število kopij v bakterijski celici, na katerega navadno ne moremo vplivati. Da bi našli pravo število kopij plazmida v celici, ki je potrebno za ekspresijo proteina, moramo za vsak eksperiment naš konstrukt klonirati v vektorje z različnimi števili kopij v celici in te vektorje transformirati v bakterijske celice. Pri tem dolgotrajnem delu pogosto pride do napak, zato so razvili sistem Tulip (TUnable Ligand Inducible Plasmid), ki omogoča enostavno in učinkovito spreminjanje števila kopij plazmida v celici [1, 2].

			==Razvoj Tulipa==
			===Plazmid pSC101===

Gregor Strniša: New page: ''Povzeto po članku:[https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E....

2023-04-24T17:16:46Z

New page: ''Povzeto po članku:[https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E....

New page

''Povzeto po članku:[https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13. ]''