Sporadicate - Revision history

GasperMozina: /* Samorazgrajujoči plazmid */

2023-05-09T20:10:57Z

Samorazgrajujoči plazmid

← Older revision		Revision as of 20:10, 9 May 2023
Line 21:		Line 21:

	== Samorazgrajujoči plazmid ==		== Samorazgrajujoči plazmid ==
	Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se z germinacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira ~~s sporulacijo~~, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].		Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se z germinacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira z germinacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

	== Receptor za reaktivacijo spor ==		== Receptor za reaktivacijo spor ==

GasperMozina: /* Samorazgrajujoči plazmid */

2023-05-09T20:09:18Z

Samorazgrajujoči plazmid

← Older revision		Revision as of 20:09, 9 May 2023
Line 21:		Line 21:

	== Samorazgrajujoči plazmid ==		== Samorazgrajujoči plazmid ==
	Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se ~~s sporulacijo~~ razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].		Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se z germinacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

	== Receptor za reaktivacijo spor ==		== Receptor za reaktivacijo spor ==

GasperMozina at 20:06, 9 May 2023

2023-05-09T20:06:45Z

← Older revision		Revision as of 20:06, 9 May 2023
Line 20:		Line 20:
	Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].		Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

	== Samorazgrajujoči~~-se~~ plazmid ==		== Samorazgrajujoči plazmid ==
	Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].		Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

GasperMozina: /* Problem */

2023-05-09T17:52:30Z

Problem

← Older revision		Revision as of 17:52, 9 May 2023
Line 2:		Line 2:

	= Problem =		= Problem =
	Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so ~~razvili~~ nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].		Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so želeli razviti nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

	= Načrt dela =		= Načrt dela =

GasperMozina: /* Konstrukcija vektorjev, kloniranja in rezultati */

2023-05-09T16:13:19Z

Konstrukcija vektorjev, kloniranja in rezultati

← Older revision		Revision as of 16:13, 9 May 2023
Line 27:		Line 27:
	Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].		Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

	== Konstrukcija vektorjev, ~~kloniranja~~ in rezultati ==		== Konstrukcija vektorjev, kloniranje in rezultati ==

	Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.		Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.

GasperMozina: /* Konstrukcija vektorjev, kloniranja in rezultati */

2023-05-09T16:13:08Z

Konstrukcija vektorjev, kloniranja in rezultati

← Older revision		Revision as of 16:13, 9 May 2023
Line 33:		Line 33:
	CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.		CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.

	Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti.[1].		Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti [1].

	= Cilji za prihodnost =		= Cilji za prihodnost =

GasperMozina at 16:12, 9 May 2023

2023-05-09T16:12:58Z

← Older revision		Revision as of 16:12, 9 May 2023
Line 21:		Line 21:

	== Samorazgrajujoči-se plazmid ==		== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
	Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].		Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

	== Receptor za reaktivacijo spor ==		== Receptor za reaktivacijo spor ==

	Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so ~~najprej~~ določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].		Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

	== Konstrukcija vektorjev in ~~proces kloniranja~~ ==		== Konstrukcija vektorjev, kloniranja in rezultati ==

	Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.		Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
	Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].		Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
	CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj ~~je klonirano~~ v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].		CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.

			Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti.[1].

	= Cilji za prihodnost =		= Cilji za prihodnost =

GasperMozina: /* Cilji za prihodnost */

2023-05-09T15:51:56Z

Cilji za prihodnost

← Older revision		Revision as of 15:51, 9 May 2023
Line 36:		Line 36:

	Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].		Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].
			Z dodatnimi finančnimi vložki se nameravajo pri projektu posvetiti inženiringu germinantnega receptorja, ki je zaenkrat načrtovan le računalniško.

	= Viri =		= Viri =
	[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/		[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

GasperMozina: /* Receptor za reaktivacijo spor */

2023-05-09T15:47:51Z

Receptor za reaktivacijo spor

← Older revision		Revision as of 15:47, 9 May 2023
Line 25:		Line 25:
	== Receptor za reaktivacijo spor ==		== Receptor za reaktivacijo spor ==

	Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje ~~so izvedli~~ z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali ~~test specifičnosti s~~ pozitivno in negativno selekcijo [1].		Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

	== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==		== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

GasperMozina: /* Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja */

2023-05-09T15:42:31Z

Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja

← Older revision		Revision as of 15:42, 9 May 2023
Line 29:		Line 29:
	== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==		== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

			Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
	Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].		Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
	CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].		CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].