Super - Revision history

Inge.Sotlar: /* Izvencelično izražanje tarčnih genov */

2018-01-15T16:06:31Z

Izvencelično izražanje tarčnih genov

← Older revision		Revision as of 16:06, 15 January 2018
Line 18:		Line 18:

	===Izvencelično izražanje tarčnih genov===		===Izvencelično izražanje tarčnih genov===
	Vsi trije encimi opravljajo svojo vlogo zunajcelično. To so pri konstruiranju dosegli z dodatkom zapisa za signalni peptid (AO-S) pred tarčni gen ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286002 BBa_K2286002]), ki poleg transporta encimov v rastlinsko celično steno omogoča stabilnejše izražanje genov. Nazadnje so skonstruirali vektor, ki je namesto gen za CKX3 vseboval še gen za ~~reporter~~ (ß-glukoronidaza - GUS), s čimer so preverili funkcionalnost multigenskih rastlinskih ekspresijskih vektorjev.		Vsi trije encimi opravljajo svojo vlogo zunajcelično. To so pri konstruiranju dosegli z dodatkom zapisa za signalni peptid (AO-S) pred tarčni gen ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286002 BBa_K2286002]), ki poleg transporta encimov v rastlinsko celično steno omogoča stabilnejše izražanje genov. Nazadnje so skonstruirali vektor, ki je namesto gen za CKX3 vseboval še gen za reporterski protein (ß-glukoronidaza - GUS), s čimer so preverili funkcionalnost multigenskih rastlinskih ekspresijskih vektorjev.

	==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==		==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==

Inge.Sotlar: /* Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka */

2018-01-15T16:04:43Z

Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka

← Older revision		Revision as of 16:04, 15 January 2018
Line 15:		Line 15:

	===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===		===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===
	1,2,3 – TCP se povečini nahaja v podtalnici in onesnaženih tleh, zato je bil načrt narediti tak konstrukt, ki bi omogočil izražanje tarčnih genov le v koreninah rastline tobaka. Da bi ragradnjo usmerili v korenine in s tem dobili večjo učinkovitost, so konstitutivni promotor CaMV35s zamenjali z rastlinskim koreninsko-specifičnim promotorjem PYK10 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286005 BBa_K2286005]) iz ''Arabidopsis thaliana''. Hkrati je bil v vektor vključen še gen za citokinin oksidazo CKX3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286004 BBa_K2286004]), ki z razgradnjo citokinina vpliva na razvoj rastline. S prekomernim izražanjem gena pa bi pospešili razvoj koreninskega sistema ~~omogočil~~ hitrejšo rast korenin.		1,2,3 – TCP se povečini nahaja v podtalnici in onesnaženih tleh, zato je bil načrt narediti tak konstrukt, ki bi omogočil izražanje tarčnih genov le v koreninah rastline tobaka. Da bi ragradnjo usmerili v korenine in s tem dobili večjo učinkovitost, so konstitutivni promotor CaMV35s zamenjali z rastlinskim koreninsko-specifičnim promotorjem PYK10 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286005 BBa_K2286005]) iz ''Arabidopsis thaliana''. Hkrati je bil v vektor vključen še gen za citokinin oksidazo CKX3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286004 BBa_K2286004]), ki z razgradnjo citokinina vpliva na razvoj rastline. S prekomernim izražanjem gena pa bi pospešili razvoj koreninskega sistema in omogočili hitrejšo rast korenin.

	===Izvencelično izražanje tarčnih genov===		===Izvencelično izražanje tarčnih genov===

Inge.Sotlar: /* Uvod */

2018-01-15T16:02:49Z

Uvod

← Older revision		Revision as of 16:02, 15 January 2018
Line 1:		Line 1:
	==Uvod==		==Uvod==

	Slabost napredka v kmetijstvu in kemični industriji so zagotovo negativni učinki toksičnih in težko razgradljivih spojin. Eden nevarnejših onesnaževalcev okolja, predvsem podtalnih voda, je halogenirana organska spojina 1,2,~~3–trikloropropan~~ (1,2,3 – TCP). Letna proizvodnja znaša okoli 50 tisoč ton, od tega se večinoma uporablja v kemični industriji kot topilo ali kot prekurzor za sintezo drugih kemikalij, npr. dikloropropena, v kmetijstvu pa kot hlapni pesticid - fumigant. Zaradi masovne proizvodnje je 1,2,3-TCP pogosto prisoten na zapuščenih industrijskih mestih, od koder prehaja v podtalnico in nato v pitno vodo. V preteklih 10-ih letih so v več državah dokazali prisotnost v pitni vodi, saj zaradi majhnega adhezijskega koeficienta vanjo lažje prehaja in s tem ogroža okolje ter zdravje ljudi.		Slabost napredka v kmetijstvu in kemični industriji so zagotovo negativni učinki toksičnih in težko razgradljivih spojin. Eden nevarnejših onesnaževalcev okolja, predvsem podtalnih voda, je halogenirana organska spojina 1,2,3-trikloropropan (1,2,3-TCP). Letna proizvodnja znaša okoli 50 tisoč ton, od tega se večinoma uporablja v kemični industriji kot topilo ali kot prekurzor za sintezo drugih kemikalij, npr. dikloropropena, v kmetijstvu pa kot hlapni pesticid - fumigant. Zaradi masovne proizvodnje je 1,2,3-TCP pogosto prisoten na zapuščenih industrijskih mestih, od koder prehaja v podtalnico in nato v pitno vodo. V preteklih 10-ih letih so v več državah dokazali prisotnost v pitni vodi, saj zaradi majhnega adhezijskega koeficienta vanjo lažje prehaja in s tem ogroža okolje ter zdravje ljudi.

	1,2,~~3–TCP~~ se v naravi težko razgradi, saj ni organizma, ki bi ta toksičen odpadni produkt lahko učinkovito odstranjeval. Načini odstranjevanja vključujejo uporabo aktivnega oglja ali reduktivno deklorinacijo z ničvalentnim železom, vendar so te metode za uporabo pri naravnih pogojih precej neučinkovite in drage. Pretekli poskusi razgradnje z bakterijami ''E. coli'' na [http://2013.igem.org/Team:UESTC_Life#/page/1 iGEM2013] niso bili uspešni, zato se je ekipa [http://2017.igem.org/Team:UESTC-China iGEM2017] s kitajske univerze UESTC odločila uporabiti metodo fitodegradacije s pomočjo »Super tobaka«.		1,2,3-TCP se v naravi težko razgradi, saj ni organizma, ki bi ta toksičen odpadni produkt lahko učinkovito odstranjeval. Načini odstranjevanja vključujejo uporabo aktivnega oglja ali reduktivno deklorinacijo z ničvalentnim železom, vendar so te metode za uporabo pri naravnih pogojih precej neučinkovite in drage. Pretekli poskusi razgradnje z bakterijami ''E. coli'' na [http://2013.igem.org/Team:UESTC_Life#/page/1 iGEM2013] niso bili uspešni, zato se je ekipa [http://2017.igem.org/Team:UESTC-China iGEM2017] s kitajske univerze UESTC odločila uporabiti metodo fitodegradacije s pomočjo »Super tobaka«.

	Cilj projekta je bilo skonstruirati encimsko pot v rastlini tobaka za petstopenjsko razgradnjo 1,2,~~3–TCP~~ v netoksičen glicerol. Iz preteklih študij je bilo znano, da sistem vključuje tri ključne encime: mutanto haloalkan dehalogenaze (DhaA31, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) iz ''Rhodococcus rhodochrous'' in mutanto halohidrin dehalogenaze (HheC-W249P, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286000 BBa_K2286000]) ter epiklorohidrin epoksid hidrolazo (EchA, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286003 BBa_K2286003]), obe izolirani iz ''Agrobacterium radiobacter'' AD1.		Cilj projekta je bilo skonstruirati encimsko pot v rastlini tobaka za petstopenjsko razgradnjo 1,2,3-TCP v netoksičen glicerol. Iz preteklih študij je bilo znano, da sistem vključuje tri ključne encime: mutanto haloalkan dehalogenaze (DhaA31, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) iz ''Rhodococcus rhodochrous'' in mutanto halohidrin dehalogenaze (HheC-W249P, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286000 BBa_K2286000]) ter epiklorohidrin epoksid hidrolazo (EchA, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286003 BBa_K2286003]), obe izolirani iz ''Agrobacterium radiobacter'' AD1.

	==Konstrukcija poti za razgradnjo 1,2,3 - TCP==		==Konstrukcija poti za razgradnjo 1,2,3 - TCP==

Inge.Sotlar: /* Uvod */

2018-01-15T16:02:06Z

Uvod

← Older revision		Revision as of 16:02, 15 January 2018
Line 1:		Line 1:
	==Uvod==		==Uvod==

	Slabost napredka v kmetijstvu in kemični industriji so zagotovo negativni učinki toksičnih in težko razgradljivih spojin. Eden nevarnejših onesnaževalcev okolja, predvsem podtalnih voda, je halogenirana organska spojina 1,2,~~3 – trikloropropan~~ (1,2,3 – TCP). Letna proizvodnja znaša okoli 50 tisoč ton, od tega se večinoma uporablja v kemični industriji kot topilo ali kot prekurzor za sintezo drugih kemikalij, npr. dikloropropena, v kmetijstvu pa kot hlapni pesticid - fumigant. Zaradi masovne proizvodnje je 1,2,3 - TCP pogosto prisoten na zapuščenih industrijskih mestih, od koder prehaja v podtalnico in nato v pitno vodo. V preteklih 10-ih letih so v več državah dokazali prisotnost v pitni vodi, saj zaradi majhnega adhezijskega koeficienta vanjo lažje prehaja in s tem ogroža okolje ter zdravje ljudi.		Slabost napredka v kmetijstvu in kemični industriji so zagotovo negativni učinki toksičnih in težko razgradljivih spojin. Eden nevarnejših onesnaževalcev okolja, predvsem podtalnih voda, je halogenirana organska spojina 1,2,3–trikloropropan (1,2,3 – TCP). Letna proizvodnja znaša okoli 50 tisoč ton, od tega se večinoma uporablja v kemični industriji kot topilo ali kot prekurzor za sintezo drugih kemikalij, npr. dikloropropena, v kmetijstvu pa kot hlapni pesticid - fumigant. Zaradi masovne proizvodnje je 1,2,3-TCP pogosto prisoten na zapuščenih industrijskih mestih, od koder prehaja v podtalnico in nato v pitno vodo. V preteklih 10-ih letih so v več državah dokazali prisotnost v pitni vodi, saj zaradi majhnega adhezijskega koeficienta vanjo lažje prehaja in s tem ogroža okolje ter zdravje ljudi.

	1,2,~~3 – TCP~~ se v naravi težko razgradi, saj ni organizma, ki bi ta toksičen odpadni produkt lahko učinkovito odstranjeval. Načini odstranjevanja vključujejo uporabo aktivnega oglja ali reduktivno deklorinacijo z ničvalentnim železom, vendar so te metode za uporabo pri naravnih pogojih precej neučinkovite in drage. Pretekli poskusi razgradnje z bakterijami ''E. coli'' na [http://2013.igem.org/Team:UESTC_Life#/page/1 iGEM2013] niso bili uspešni, zato se je ekipa [http://2017.igem.org/Team:UESTC-China iGEM2017] s kitajske univerze UESTC odločila uporabiti metodo fitodegradacije s pomočjo »Super tobaka«.		1,2,3–TCP se v naravi težko razgradi, saj ni organizma, ki bi ta toksičen odpadni produkt lahko učinkovito odstranjeval. Načini odstranjevanja vključujejo uporabo aktivnega oglja ali reduktivno deklorinacijo z ničvalentnim železom, vendar so te metode za uporabo pri naravnih pogojih precej neučinkovite in drage. Pretekli poskusi razgradnje z bakterijami ''E. coli'' na [http://2013.igem.org/Team:UESTC_Life#/page/1 iGEM2013] niso bili uspešni, zato se je ekipa [http://2017.igem.org/Team:UESTC-China iGEM2017] s kitajske univerze UESTC odločila uporabiti metodo fitodegradacije s pomočjo »Super tobaka«.

	Cilj projekta je bilo skonstruirati encimsko pot v rastlini tobaka za petstopenjsko razgradnjo 1,2,~~3 –TCP~~ v netoksičen glicerol. Iz preteklih študij je bilo znano, da sistem vključuje tri ključne encime: mutanto haloalkan dehalogenaze (DhaA31, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) iz ''Rhodococcus rhodochrous'' in mutanto halohidrin dehalogenaze (HheC-W249P, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286000 BBa_K2286000]) ter epiklorohidrin epoksid hidrolazo (EchA, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286003 BBa_K2286003]), obe izolirani iz ''Agrobacterium radiobacter'' AD1.		Cilj projekta je bilo skonstruirati encimsko pot v rastlini tobaka za petstopenjsko razgradnjo 1,2,3–TCP v netoksičen glicerol. Iz preteklih študij je bilo znano, da sistem vključuje tri ključne encime: mutanto haloalkan dehalogenaze (DhaA31, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) iz ''Rhodococcus rhodochrous'' in mutanto halohidrin dehalogenaze (HheC-W249P, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286000 BBa_K2286000]) ter epiklorohidrin epoksid hidrolazo (EchA, [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286003 BBa_K2286003]), obe izolirani iz ''Agrobacterium radiobacter'' AD1.

	==Konstrukcija poti za razgradnjo 1,2,3 - TCP==		==Konstrukcija poti za razgradnjo 1,2,3 - TCP==

Inge.Sotlar: /* Modeliranje */

2018-01-15T16:01:00Z

Modeliranje

← Older revision		Revision as of 16:01, 15 January 2018
Line 38:		Line 38:

	==Modeliranje==		==Modeliranje==
	Za natančen vpogled v dinamiko encimskega sistema so sestavili matematični model, postavljen model pa preverili z vstavljanjem eksperimentalnih podatkov, pridobljenih iz znanstvenega članka. Na podlagi rezultatov so nato s pomočjo ~~postavljenega~~ modela optimizirali sistem in sicer so izbrali ustrezno mutirane encime ter določili njihova optimalna stehiometrična razmerja v vsaki stopnji razgradne poti. Pri tem so upoštevali faktorje, ki otežujejo študije, kot je npr. inhibicija encima z enim od produktov ali afinitet encima do različnih substratov.		Za natančen vpogled v dinamiko encimskega sistema so sestavili matematični model, postavljen model pa preverili z vstavljanjem eksperimentalnih podatkov, pridobljenih iz znanstvenega članka. Na podlagi rezultatov so nato s pomočjo modela optimizirali sistem in sicer so izbrali ustrezno mutirane encime ter določili njihova optimalna stehiometrična razmerja v vsaki stopnji razgradne poti. Pri tem so upoštevali faktorje, ki otežujejo študije, kot je npr. inhibicija encima z enim od produktov ali afinitet encima do različnih substratov.

Inge.Sotlar: /* Modeliranje */

2018-01-15T16:00:31Z

Modeliranje

← Older revision		Revision as of 16:00, 15 January 2018
Line 38:		Line 38:

	==Modeliranje==		==Modeliranje==
			Za natančen vpogled v dinamiko encimskega sistema so sestavili matematični model, postavljen model pa preverili z vstavljanjem eksperimentalnih podatkov, pridobljenih iz znanstvenega članka. Na podlagi rezultatov so nato s pomočjo postavljenega modela optimizirali sistem in sicer so izbrali ustrezno mutirane encime ter določili njihova optimalna stehiometrična razmerja v vsaki stopnji razgradne poti. Pri tem so upoštevali faktorje, ki otežujejo študije, kot je npr. inhibicija encima z enim od produktov ali afinitet encima do različnih substratov.

Inge.Sotlar: /* Aktivnost encimov */

2018-01-15T15:40:56Z

Aktivnost encimov

← Older revision		Revision as of 15:40, 15 January 2018
Line 29:		Line 29:
	===Aktivnost encimov===		===Aktivnost encimov===
	Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,3–TCP v 2,3-dikloropropan-1-ol (2,3–DCP), je bila po dodatku 5 mM 1,2,3–TCP višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,3–DCP niso detektirali.		Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,3–TCP v 2,3-dikloropropan-1-ol (2,3–DCP), je bila po dodatku 5 mM 1,2,3–TCP višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,3–DCP niso detektirali.
	Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov (ECH in GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna ''E. coli''. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,~~3 – TCP~~.		Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov (ECH in GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna ''E. coli''. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,3–TCP.
	V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila opazna razgradnja ECH v CPD tudi pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.		V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila opazna razgradnja ECH v CPD tudi pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.

	Celotno razgradno pot v tobaku so testirali tako v listih tobaka s piGEM2017-004, kot tudi s piGEM2017-005, kjer je prisotna endogena epoksid hidrolaza EchA. V reakcijsko mešanico so dodali HheC, izoliranega iz rekombinantne ''E. coli'', in spremljali uspešnost pretvorbe 1,2,~~3 – TCP~~ v glicerol. Proizvodnjo glicerola, končnega produkta, so spremljali s kombinacijo plinske kromatografije in masne spektrometrije (GC-MS). Glicerol se je pri obeh vzorcih proizvajal sorazmerno z razgradnjo 1,2,3-TCP, in po 30-ih urah je bila razgradnja 80-odstotna.		Celotno razgradno pot v tobaku so testirali tako v listih tobaka s piGEM2017-004, kot tudi s piGEM2017-005, kjer je prisotna endogena epoksid hidrolaza EchA. V reakcijsko mešanico so dodali HheC, izoliranega iz rekombinantne ''E. coli'', in spremljali uspešnost pretvorbe 1,2,3–TCP v glicerol. Proizvodnjo glicerola, končnega produkta, so spremljali s kombinacijo plinske kromatografije in masne spektrometrije (GC-MS). Glicerol se je pri obeh vzorcih proizvajal sorazmerno z razgradnjo 1,2,3-TCP, in po 30-ih urah je bila razgradnja 80-odstotna.

	===Aktivnost encimov v hidroponičnih raztopinah===		===Aktivnost encimov v hidroponičnih raztopinah===

Inge.Sotlar: /* Aktivnost encimov */

2018-01-15T15:40:15Z

Aktivnost encimov

← Older revision		Revision as of 15:40, 15 January 2018
Line 32:		Line 32:
	V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila opazna razgradnja ECH v CPD tudi pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.		V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila opazna razgradnja ECH v CPD tudi pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.

	Celotno razgradno pot v tobaku so testirali tako v listih tobaka s piGEM2017-004, kot tudi s piGEM2017-005, kjer je prisotna endogena epoksid hidrolaza EchA. V reakcijsko mešanico so dodali HheC, izoliranega iz ''E. coli'', in spremljali uspešnost pretvorbe 1,2,3 – TCP v glicerol. Proizvodnjo glicerola, končnega produkta, so spremljali s kombinacijo plinske kromatografije in masne spektrometrije (GC-MS). Glicerol se je pri obeh vzorcih proizvajal sorazmerno z razgradnjo 1,2,3-TCP, in po 30-ih urah je bila razgradnja 80-odstotna.		Celotno razgradno pot v tobaku so testirali tako v listih tobaka s piGEM2017-004, kot tudi s piGEM2017-005, kjer je prisotna endogena epoksid hidrolaza EchA. V reakcijsko mešanico so dodali HheC, izoliranega iz rekombinantne ''E. coli'', in spremljali uspešnost pretvorbe 1,2,3 – TCP v glicerol. Proizvodnjo glicerola, končnega produkta, so spremljali s kombinacijo plinske kromatografije in masne spektrometrije (GC-MS). Glicerol se je pri obeh vzorcih proizvajal sorazmerno z razgradnjo 1,2,3-TCP, in po 30-ih urah je bila razgradnja 80-odstotna.

	===Aktivnost encimov v hidroponičnih raztopinah===		===Aktivnost encimov v hidroponičnih raztopinah===

Inge.Sotlar: /* Aktivnost encimov */

2018-01-15T15:39:08Z

Aktivnost encimov

← Older revision		Revision as of 15:39, 15 January 2018
Line 28:		Line 28:

	===Aktivnost encimov===		===Aktivnost encimov===
	Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,~~3 – TCP~~ v 2,3-dikloropropan-1-ol (2,3–DCP), je bila po dodatku 5 mM 1,2,~~3 – TCP~~ višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,~~3 – DP~~ niso detektirali.		Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,3–TCP v 2,3-dikloropropan-1-ol (2,3–DCP), je bila po dodatku 5 mM 1,2,3–TCP višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,3–DCP niso detektirali.
	Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov (ECH in GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna ''E. coli''. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,3 – TCP.		Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov (ECH in GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna ''E. coli''. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,3 – TCP.
	V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila opazna razgradnja ECH v CPD tudi pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.		V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila opazna razgradnja ECH v CPD tudi pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.

Inge.Sotlar: /* Izvencelično izražanje tarčnih genov */

2018-01-15T15:38:20Z

Izvencelično izražanje tarčnih genov

← Older revision		Revision as of 15:38, 15 January 2018
Line 18:		Line 18:

	===Izvencelično izražanje tarčnih genov===		===Izvencelično izražanje tarčnih genov===
	Vsi trije encimi opravljajo svojo vlogo zunajcelično. To so pri konstruiranju dosegli z dodatkom zapisa za signalni peptid (AO-S) pred tarčni gen ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286002 BBa_K2286002]), ki poleg transporta encimov v rastlinsko celično steno omogoča stabilnejše izražanje genov. Nazadnje so skonstruirali vektor, ki je namesto gen za CKX3 vseboval še gen za reporter (ß- glukoronidaza - GUS), s čimer so preverili ~~če multigenski rastlinski ekspresijski vektorji lahko opravijo svojo nalogo~~.		Vsi trije encimi opravljajo svojo vlogo zunajcelično. To so pri konstruiranju dosegli z dodatkom zapisa za signalni peptid (AO-S) pred tarčni gen ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2286002 BBa_K2286002]), ki poleg transporta encimov v rastlinsko celično steno omogoča stabilnejše izražanje genov. Nazadnje so skonstruirali vektor, ki je namesto gen za CKX3 vseboval še gen za reporter (ß-glukoronidaza - GUS), s čimer so preverili funkcionalnost multigenskih rastlinskih ekspresijskih vektorjev.

	==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==		==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==