Super tobak - Revision history

Inge.Sotlar: /* Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku */

2018-01-15T20:52:44Z

Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku

← Older revision		Revision as of 20:52, 15 January 2018
Line 12:		Line 12:

	===Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku===		===Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku===
	Za izražanje tarčnih genov v tobaku so najprej naredili optimizacijo kodonov, potem pa so sintetizirali posamezne gene za encime DhaA31, HheC-W249P in EchA. Z uporabo peptida 2A in metode Golden Gate so uspešno vnesli posamezni tarčni gen v vektor piGEM2017 (skelet), pod kontrolo konstitutivnega promotorja CaMV35s. V četrti vektor so vnesli vse tri gene, v zadnjega pa le dva; dobili so naslednje vektorje: ''piGEM2017-001'' (DhaA), ''piGEM2017-002'' (HheC-W249P), ''piGEM2017-003'' (EchA), ''piGEM2017-004'' (DhaA, HheC-W249P in EchA) ter ''piGEM2017-005'' (DhaA, HheC-W249P)		Za izražanje tarčnih genov v tobaku so najprej naredili optimizacijo kodonov, potem pa so sintetizirali posamezne gene za encime DhaA31, HheC-W249P in EchA. Z uporabo peptida 2A in metode "Golden Gate" so uspešno vnesli posamezni tarčni gen v vektor piGEM2017 (skelet), pod kontrolo konstitutivnega promotorja CaMV35s. V četrti vektor so vnesli vse tri gene, v zadnjega pa le dva; dobili so naslednje vektorje: ''piGEM2017-001'' (DhaA), ''piGEM2017-002'' (HheC-W249P), ''piGEM2017-003'' (EchA), ''piGEM2017-004'' (DhaA, HheC-W249P in EchA) ter ''piGEM2017-005'' (DhaA, HheC-W249P)

	===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===		===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===

Inge.Sotlar: /* Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin */

2018-01-15T20:44:47Z

Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin

← Older revision		Revision as of 20:44, 15 January 2018
Line 21:		Line 21:

	==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==		==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==
	Za vnos tujih genov v tobak, ki sodi med dvokaličnice, so uporabili transformacijo z ''Agrobacterium''. Plazmide so vnesli v ''Agrobacterium'' EHA105, s pomočjo katere so fragment T-DNA s tarčnimi geni integrirali v kromosom tobaka. Po približno desetih tednih so izselekcionirali tiste kaluse, ki so bili odporni na kanamicin, in jih vzgojili v rastline ~~tobaka~~.		Za vnos tujih genov v tobak, ki sodi med dvokaličnice, so uporabili transformacijo z ''Agrobacterium''. Plazmide so vnesli v ''Agrobacterium'' EHA105, s pomočjo katere so fragment T-DNA s tarčnimi geni integrirali v kromosom tobaka. Po infekciji tobaka so po približno desetih tednih izselekcionirali tiste kaluse, ki so bili odporni na kanamicin, in jih vzgojili v rastline. Z ekstrakcijo genomske DNA prve generacije transgenskega tobaka in z reakcijo PCR, za pomnoževanje tarčnih genov DhaA31, HheC-W249P in EchA, so nato izbrali transgene rastline z ustreznim vključkom. V primerjavi z divjim tipom je bilo pomnoževanje uspešno, kar kaže na uspešno izražanje genov za multiencimski sistem. Prisotnost in delovanje multiencimskega sistema so dokazali še s histokemijskem obarvanjem s substratom za GUS, X-Gluc. Korenine transgenih rastlin, z vključenim genom za GUS, so bile po 24-ih urah obarvane modro.
	Z ekstrakcijo genomske DNA prve generacije transgenskega tobaka in z reakcijo PCR, za pomnoževanje tarčnih genov DhaA31, HheC-W249P in EchA, so nato izbrali transgene rastline z ustreznim vključkom. V primerjavi z divjim tipom je bilo pomnoževanje uspešno, kar kaže na uspešno izražanje genov za multiencimski sistem. Prisotnost in delovanje multiencimskega sistema so dokazali še s histokemijskem obarvanjem z X-~~gluc~~. Korenine transgenih rastlin, z vključenim genom GUS, so bile po 24-ih urah obarvane modro.

	==Rezultati==		==Rezultati==

Inge.Sotlar: /* Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin */

2018-01-15T20:34:50Z

Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin

← Older revision		Revision as of 20:34, 15 January 2018
Line 21:		Line 21:

	==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==		==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==
	Za vnos tujih genov v tobak, ki sodi med dvokaličnice, so uporabili transformacijo z ''Agrobacterium''. Plazmide so vnesli v ''Agrobacterium'' EHA105, s pomočjo katere so fragment T-DNA s tarčnimi geni integrirali v kromosom tobaka. Po približno desetih tednih so ~~preko rastlinske tkivne kulture (kalusa) dobili transgeni tobak~~.		Za vnos tujih genov v tobak, ki sodi med dvokaličnice, so uporabili transformacijo z ''Agrobacterium''. Plazmide so vnesli v ''Agrobacterium'' EHA105, s pomočjo katere so fragment T-DNA s tarčnimi geni integrirali v kromosom tobaka. Po približno desetih tednih so izselekcionirali tiste kaluse, ki so bili odporni na kanamicin, in jih vzgojili v rastline tobaka.
	Z ekstrakcijo genomske DNA prve generacije transgenskega tobaka in ~~reakcije~~ PCR, za pomnoževanje tarčnih genov DhaA31, HheC-W249P in EchA, so izbrali transgene rastline z ustreznim vključkom. V primerjavi z divjim tipom je bilo pomnoževanje uspešno, kar kaže na uspešno izražanje genov za multiencimski sistem. Prisotnost in delovanje multiencimskega sistema so dokazali še s histokemijskem obarvanjem z X-gluc. Korenine transgenih rastlin, z vključenim genom GUS, so bile po 24-ih urah obarvane modro.		Z ekstrakcijo genomske DNA prve generacije transgenskega tobaka in z reakcijo PCR, za pomnoževanje tarčnih genov DhaA31, HheC-W249P in EchA, so nato izbrali transgene rastline z ustreznim vključkom. V primerjavi z divjim tipom je bilo pomnoževanje uspešno, kar kaže na uspešno izražanje genov za multiencimski sistem. Prisotnost in delovanje multiencimskega sistema so dokazali še s histokemijskem obarvanjem z X-gluc. Korenine transgenih rastlin, z vključenim genom GUS, so bile po 24-ih urah obarvane modro.

	==Rezultati==		==Rezultati==

Inge.Sotlar: /* Rezultati */

2018-01-15T20:27:32Z

Rezultati

← Older revision		Revision as of 20:27, 15 January 2018
Line 25:		Line 25:

	==Rezultati==		==Rezultati==
	Za detekcijo aktivnosti multiencimskega sistema ''in vitro'' oz. za določitev koncentracij vseh metabolitov razgradne poti 1,2,3–TCP so uporabili plinsko kromatografijo. Na projektu so ~~se osredotočili le na~~ aktivnost encimov v listih.		Za detekcijo aktivnosti multiencimskega sistema ''in vitro'' oz. za določitev koncentracij vseh metabolitov razgradne poti 1,2,3–TCP so uporabili plinsko kromatografijo. Na projektu so določali aktivnost encimov le v listih.

	===Aktivnost encimov===		===Aktivnost encimov===
	Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,3–TCP v 2,3-dikloropropan-1-ol (2,3–DCP), je bila po dodatku 5 mM 1,2,3–TCP višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,3–DCP niso ~~detektirali~~.		Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,3–TCP v 2,3-dikloropropan-1-ol (2,3–DCP), je bila po dodatku 5 mM 1,2,3–TCP višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,3–DCP niso zaznali.
	Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in 3-kloropropan-1,2-diola - CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov - epiklorohidrina (ECH) in glicidola (GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna ''E. coli''. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,3–TCP.		Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in 3-kloropropan-1,2-diola - CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov - epiklorohidrina (ECH) in glicidola (GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna ''E. coli''. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,3–TCP.
	V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila prav tako opazna razgradnja ECH v CPD pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.		V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila prav tako opazna razgradnja ECH v CPD pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.

Inge.Sotlar: /* Zaključek */

2018-01-15T20:24:19Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 20:24, 15 January 2018
Line 41:		Line 41:

	==Zaključek==		==Zaključek==
	Namen projekta iGEM2017 skupine s kitajske univerze UESTC je bilo skonstruirati encimski sistem za razgradnjo okoljskega onesnaževalca 1,2,3-TCP v glicerol. Za šasijo so si izbrali tobak. Pri DhaA31 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) so dokazali delovanje encima, dobili pa so tudi informacije o strukturi, mehanizmu reakcije in kinetičnih konstantah ter raziskali vpliv pH in temperature na njegovo aktivnost. Modificirati jim je uspelo tudi encim HheC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2013002 BBa_K2013002]), ki ima potencialno vlogo pri nadzorovanju onesnaževanja okolja, saj je ključen pri razgradnji organskih ~~halidov~~. Potrebne so še nadaljnje raziskave za zaznavanje učinkovitosti razgradnje 1,2,3-TCP v tobaku z zapisi za vse tri encime, skupaj s signalnim peptidom AO-S in citokinin oksidazo CKX3, ki so pod kontrolo tkivno specifičnega promotorja PYK10. Med drugim bo potrebno raziskati tudi delovanje sistema pri tobaku, ki bi ga posadili v kontaminirano zemljo.		Namen projekta iGEM2017 skupine s kitajske univerze UESTC je bilo skonstruirati encimski sistem za razgradnjo okoljskega onesnaževalca 1,2,3-TCP v glicerol. Za šasijo so si izbrali tobak. Pri DhaA31 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) so dokazali delovanje encima, dobili pa so tudi informacije o strukturi, mehanizmu reakcije in kinetičnih konstantah ter raziskali vpliv pH in temperature na njegovo aktivnost. Modificirati jim je uspelo tudi encim HheC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2013002 BBa_K2013002]), ki ima potencialno vlogo pri nadzorovanju onesnaževanja okolja, saj je ključen pri razgradnji organskih halogenidov. Potrebne so še nadaljnje raziskave za zaznavanje učinkovitosti razgradnje 1,2,3-TCP v tobaku z zapisi za vse tri encime, skupaj s signalnim peptidom AO-S in citokinin oksidazo CKX3, ki so pod kontrolo tkivno specifičnega promotorja PYK10. Med drugim bo potrebno raziskati tudi delovanje sistema pri tobaku, ki bi ga posadili v kontaminirano zemljo.

	(Inge Sotlar)		(Inge Sotlar)

Inge.Sotlar: /* Zaključek */

2018-01-15T20:23:05Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 20:23, 15 January 2018
Line 41:		Line 41:

	==Zaključek==		==Zaključek==
	Namen projekta iGEM2017 skupine s kitajske univerze UESTC je bilo skonstruirati encimski sistem za razgradnjo okoljskega onesnaževalca 1,2,3-TCP v glicerol. Za šasijo so si izbrali tobak. Pri DhaA31 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) so dokazali delovanje encima, dobili pa so tudi informacije o strukturi, mehanizmu reakcije in kinetičnih ~~konstant~~ ter raziskali vpliv pH in temperature na njegovo aktivnost. Modificirati jim je uspelo tudi HheC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2013002 BBa_K2013002]), ki ima potencialno vlogo pri nadzorovanju onesnaževanja okolja, saj je ključen pri razgradnji organskih halidov. Potrebne so še nadaljnje raziskave za zaznavanje učinkovitosti razgradnje 1,2,3-TCP v tobaku z zapisi za vse tri encime, skupaj s signalnim peptidom AO-S in citokinin oksidazo CKX3, ki so pod kontrolo tkivno specifičnega promotorja PYK10. Med drugim bo potrebno raziskati tudi delovanje sistema pri tobaku, ki bi ga posadili v kontaminirano zemljo.		Namen projekta iGEM2017 skupine s kitajske univerze UESTC je bilo skonstruirati encimski sistem za razgradnjo okoljskega onesnaževalca 1,2,3-TCP v glicerol. Za šasijo so si izbrali tobak. Pri DhaA31 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) so dokazali delovanje encima, dobili pa so tudi informacije o strukturi, mehanizmu reakcije in kinetičnih konstantah ter raziskali vpliv pH in temperature na njegovo aktivnost. Modificirati jim je uspelo tudi encim HheC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2013002 BBa_K2013002]), ki ima potencialno vlogo pri nadzorovanju onesnaževanja okolja, saj je ključen pri razgradnji organskih halidov. Potrebne so še nadaljnje raziskave za zaznavanje učinkovitosti razgradnje 1,2,3-TCP v tobaku z zapisi za vse tri encime, skupaj s signalnim peptidom AO-S in citokinin oksidazo CKX3, ki so pod kontrolo tkivno specifičnega promotorja PYK10. Med drugim bo potrebno raziskati tudi delovanje sistema pri tobaku, ki bi ga posadili v kontaminirano zemljo.

	(Inge Sotlar)		(Inge Sotlar)

Inge.Sotlar: /* Zaključek */

2018-01-15T20:22:04Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 20:22, 15 January 2018
Line 41:		Line 41:

	==Zaključek==		==Zaključek==
	Namen projekta iGEM2017 skupine s kitajske univerze UESTC je bilo skonstruirati encimski sistem za razgradnjo okoljskega onesnaževalca 1,2,3-TCP v glicerol. Za šasijo so si izbrali tobak. Pri DhaA31 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) so dokazali delovanje encima, dobili pa so tudi informacije o strukturi, mehanizmu reakcije in kinetičnih konstant ter raziskali vpliv pH in temperature na njegovo aktivnost. Modificirati jim je uspelo tudi HheC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2013002 BBa_K2013002]), ki ima potencialno vlogo pri nadzorovanju onesnaževanja okolja, saj je ključen pri razgradnji organskih halidov. Potrebne so še nadaljnje raziskave za zaznavanje učinkovitosti razgradnje 1,2,3-TCP v tobaku z zapisi za vse tri encime, skupaj s signalnim peptidom AO-S in citokinin oksidazo CKX3, ki so pod kontrolo tkivno specifičnega promotorja PYK10. Med drugim bo potrebno ~~raiziskati~~ tudi delovanje sistema pri tobaku, ~~posajenem~~ v ~~onesnaženo~~ zemljo.		Namen projekta iGEM2017 skupine s kitajske univerze UESTC je bilo skonstruirati encimski sistem za razgradnjo okoljskega onesnaževalca 1,2,3-TCP v glicerol. Za šasijo so si izbrali tobak. Pri DhaA31 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) so dokazali delovanje encima, dobili pa so tudi informacije o strukturi, mehanizmu reakcije in kinetičnih konstant ter raziskali vpliv pH in temperature na njegovo aktivnost. Modificirati jim je uspelo tudi HheC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2013002 BBa_K2013002]), ki ima potencialno vlogo pri nadzorovanju onesnaževanja okolja, saj je ključen pri razgradnji organskih halidov. Potrebne so še nadaljnje raziskave za zaznavanje učinkovitosti razgradnje 1,2,3-TCP v tobaku z zapisi za vse tri encime, skupaj s signalnim peptidom AO-S in citokinin oksidazo CKX3, ki so pod kontrolo tkivno specifičnega promotorja PYK10. Med drugim bo potrebno raziskati tudi delovanje sistema pri tobaku, ki bi ga posadili v kontaminirano zemljo.

	(Inge Sotlar)		(Inge Sotlar)

Inge.Sotlar: /* Zaključek */

2018-01-15T20:19:35Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 20:19, 15 January 2018
Line 41:		Line 41:

	==Zaključek==		==Zaključek==
	Namen projekta iGEM2017 skupine z univerze UESTC ~~na Kitajskem~~ je bilo skonstruirati encimski sistem za razgradnjo onesnaževalca 1,2,3-TCP v glicerol. Za šasijo so si izbrali tobak. Pri DhaA31 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) so dokazali delovanje encima, dobili pa so tudi informacije o strukturi, mehanizmu reakcije in kinetičnih konstant ter raziskali vpliv pH in temperature na njegovo aktivnost. Modificirati jim je uspelo tudi HheC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2013002 BBa_K2013002]), ki ima potencialno vlogo pri nadzorovanju onesnaževanja okolja, saj je ključen pri razgradnji organskih halidov. Potrebne so še nadaljnje raziskave za zaznavanje učinkovitosti razgradnje 1,2,3-TCP v tobaku z zapisi za vse tri encime, skupaj s signalnim peptidom AO-S in citokinin oksidazo CKX3, ki so pod kontrolo tkivno specifičnega promotorja PYK10. Med drugim bo potrebno raiziskati tudi delovanje sistema pri tobaku, posajenem v onesnaženo zemljo.		Namen projekta iGEM2017 skupine s kitajske univerze UESTC je bilo skonstruirati encimski sistem za razgradnjo okoljskega onesnaževalca 1,2,3-TCP v glicerol. Za šasijo so si izbrali tobak. Pri DhaA31 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K1199043 BBa_K1199043]) so dokazali delovanje encima, dobili pa so tudi informacije o strukturi, mehanizmu reakcije in kinetičnih konstant ter raziskali vpliv pH in temperature na njegovo aktivnost. Modificirati jim je uspelo tudi HheC ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2013002 BBa_K2013002]), ki ima potencialno vlogo pri nadzorovanju onesnaževanja okolja, saj je ključen pri razgradnji organskih halidov. Potrebne so še nadaljnje raziskave za zaznavanje učinkovitosti razgradnje 1,2,3-TCP v tobaku z zapisi za vse tri encime, skupaj s signalnim peptidom AO-S in citokinin oksidazo CKX3, ki so pod kontrolo tkivno specifičnega promotorja PYK10. Med drugim bo potrebno raiziskati tudi delovanje sistema pri tobaku, posajenem v onesnaženo zemljo.

	(Inge Sotlar)		(Inge Sotlar)

Inge.Sotlar: /* Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku */

2018-01-15T20:18:21Z

Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku

← Older revision		Revision as of 20:18, 15 January 2018
Line 12:		Line 12:

	===Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku===		===Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku===
	Za izražanje tarčnih genov v tobaku so najprej naredili optimizacijo kodonov, potem pa so sintetizirali posamezne gene za encime DhaA31, HheC-W249P in EchA. Z uporabo ~~virusnega~~ peptida 2A in metode Golden Gate so uspešno vnesli posamezni tarčni gen v vektor piGEM2017 (skelet), pod kontrolo konstitutivnega promotorja CaMV35s. V četrti vektor so vnesli vse tri gene, v zadnjega pa le dva; dobili so naslednje vektorje: ''piGEM2017-001'' (DhaA), ''piGEM2017-002'' (HheC-W249P), ''piGEM2017-003'' (EchA), ''piGEM2017-004'' (DhaA, HheC-W249P in EchA) ter ''piGEM2017-005'' (DhaA, HheC-W249P)		Za izražanje tarčnih genov v tobaku so najprej naredili optimizacijo kodonov, potem pa so sintetizirali posamezne gene za encime DhaA31, HheC-W249P in EchA. Z uporabo peptida 2A in metode Golden Gate so uspešno vnesli posamezni tarčni gen v vektor piGEM2017 (skelet), pod kontrolo konstitutivnega promotorja CaMV35s. V četrti vektor so vnesli vse tri gene, v zadnjega pa le dva; dobili so naslednje vektorje: ''piGEM2017-001'' (DhaA), ''piGEM2017-002'' (HheC-W249P), ''piGEM2017-003'' (EchA), ''piGEM2017-004'' (DhaA, HheC-W249P in EchA) ter ''piGEM2017-005'' (DhaA, HheC-W249P)

	===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===		===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===

Inge.Sotlar: /* Viri */

2018-01-15T20:16:21Z

Viri

← Older revision		Revision as of 20:16, 15 January 2018
Line 47:		Line 47:
	==Viri==		==Viri==
	- [http://2017.igem.org/Team:UESTC-China iGEM2017 UESTC-China] <br>		- [http://2017.igem.org/Team:UESTC-China iGEM2017 UESTC-China] <br>
	- Dvorak, P., Bidmanova, S., Damborsky, J. in Prokop, Z (2014). "Immobilized Synthetic Pathway for Biodegradation of Toxic Recalcitrant Pollutant 1,2,3-Trichloropropane." Environmental Science & Technology, 48, 6859−6866.		- Dvorak, P., Bidmanova, S., Damborsky, J. in Prokop, Z. (2014). "Immobilized Synthetic Pathway for Biodegradation of Toxic Recalcitrant Pollutant 1,2,3-Trichloropropane." Environmental Science & Technology, 48, 6859−6866.