Talk:Reprogramiranje celic - Revision history

UrskaRauter: Removing all content from page

2013-05-27T21:43:43Z

Removing all content from page

← Older revision		Revision as of 21:43, 27 May 2013
Line 1:		Line 1:
	~~= Kombiniranje tehnologije induciranih pluripotentnih matičnih celic in genskih modifikacij pri zdravljenju mišične distrofije =~~



	~~==Mišična distrofija==~~
	Prvi opisi bolezni segajo v leto 1836, ko sta pojemanje mišične moči opisala Conte in Gioja, vendar sta simptome pripisala tuberkulozi. Gensko pogojenost pa je leta 1852 predvidel Meryon, ki je predpostavil, da se bolezen gensko prenaša preko mame in prizadene predvsem moške potomce.
	~~Duchennova mišična distrofija je poimenovana po Guillaume Duchennu, francoskem nevrologu, ki je podrobno opisal tovrstno mišično bolezen.~~
	Duchennova mišična distrofija prizadene kortikospinalni sistem, natančneje sprednje rogove aferentnih nevronov. Posledica je denevracija mišič oziroma oslabljen sistem motoričnih ploščič. Za bolezen je značilna progresivnost, s predela dlani preko udov in kasneje celotnega telesa. V povprečju so za bolezen dovzetnejši moški, od katerih jih je 5-10% bolezen delovalo avtosomno dominantno. Zdravljenje je simptomatično; kombinacija fizioterapije in antiholinergikov.

	~~===Molekularne osnove Duchennove mišične distrofije (DMD)===~~
	Razlog, da bolezen v večini prizadene moške je v tem, da je vezana na X kromosom. Incidenca bolezni je ocenjena na 1/3.500 moških (Engel in Banker 1986). Prizadet gen za protein distrofin ima v povprečju 65 eksonov in okoli 2000 kb (Koenig et al. 1987; van Ommen et al. 1987; Burmeister et al. 1988).
	Pravilno zvit protein je velik 427 kDa in ima štiri domene; N-terminalna domeno, paličasto domeno, s cisteinom bogato domeno in C-terminalno domeno (Koenig et al. 1988). Najdemo ga v sarkolemi skeletnih mišic ter na stikih med mišičnimi vlakni in tetivami. Njegova glavna naloge je stabilizacija sarkoleme preko vezave aktina. Prav tako pa so heliksi paličaste domene fleksibilni in elastični kar še dodatno ščiti miofibrile pred mehanskim stresom. Poleg omenjenih funkcij, sodeluje še pri vzpostavitvi stika med sarkolemo in citoskeletom (Rybakova et. al 2000). Glede na posledice ob njegovi odsotnosti, predvidevajo, da ima vlogo tudi v medcelični signalizaciji. Pravilno lahko deluje le v kompleksu s t.i. »Z distrofinom povezanim proteinskim kompleksom« (Davies & Nowak 2006).
	Najpogostejši defekt gena je intragenska delecija (Forrest et al. 1987; Koenig et al. 1987), kar privede do vezave eksonov, ki onemogočajo translacijo na bralnem okvirju. Takšno hipotezo podpira Westrn blot analiza distrofina, ki je nezaznaven pri pacientih z DMD. Podana je bila tudi hipoteza, da do delecije pride že v prvih desetih eksonih (Malhotra et al. 1988). Koenig et al. (1989) so analizirali delecije na večini gena in določili njihove posledice na mRNA ter bralni okvir. Posledice delecije na bralnem okvirju so analizirali preko intron-ekson meje, med tistima dvema eksonoma, ki sta bila ob boku delecije. Določene so bile tri meje glede na njihov položaj v kodirajočem tripletu. Dve od mej sta vodili do delecije, medtem ko je ena ohranila bralni okvir. Ugotovili so, da lahko 92% delecij pojasnijo kot delecije na bralnem okvirju, le 5 delecij pa se je zgodilo že pred vzpostavitvijo bralnega okvira. Takšna oblika delecije je namreč bolj značilna za druge oblike mišične distrofije. Pri DMD tako v povprečju pričakujemo alteracije na regiji bogati s cisteinom ter na C terminalni domeni, ki vodijo v hujše oblike mišične distrofije.

	~~==Napredki na področju zdravljenja DMD==~~
	Strategije za zdravljenje DMD lahko razdelimo v štiri kategorije: celična terapija, terapija z zamenjavo genov, supresija nezrelih terminacijskih kodonov in "Preskakovanje eksonov" oziroma v angleščini ''exon skipping''

	~~V seminarski nalogi se bom usmerila na celično terapijo, vse ostale oblike terapij pa so podrobno opisane '''v viru'''~~

	Na področju celične terapije je seveda poudarek na uporabi matičnih celic ali pluripotentnih mišičnih celic. Do sedaj je največ uspeha prinesla transplantacija mioblastov v prizadeto (distrofično) tkivo. Mioblasti so se sposobni diferencirati miofibrile, ki so nujne za pravilno delovanje skeletne mišice. Rezultate te transplantacije označujemo za fenomen imenovan »gensko dopolnjevanje«, kar pomeni ekspresijo eksogenih in gostiteljskih genov v mišičnem sinciciju (Watt et al. 1982). Raziskave so nadaljevali na gensko modificiranih mdx miših in zavoljo odličnih rezultatov poizkusili še na ljudeh, vendar je bil izkoristek, žal, prenizek (Mendell et al. 1995). Raziskave na področju transplantacije mioblastov so bile zelo plodne tudi na višjih sesalcih in trenutni trend je raziskovanje optimalnega imunosupresanta, izboljšanje migracije mioblastov ter izračuna optimalnega števila transplantiranih celic. Največja ovira celične terapije je insercija celic, saj se (trenutno) injicirajo le intramuskularno (Partridge, 1991) in ne intravenozno kakor bi bilo zaželeno. Intamuskularno injiciranje otežuje terapijo ne le zaradi nedosegljivosti določenih mišic (npr. difragma), temveč tudi zaradi omejitve diferenciacije mioblastov na posamezna področja v mišici. Do leta 2011 sta bili prijavljeni dve klinični raziskavi na tem področju (Torrente et al. in Guilio Cossu).

	~~===Kombinacija genetike in pluripotentnih (iPS) celic===~~

	Leta 2012 so na Univerzi Minessota raziskovalci (Filareto et. al) naredili velik premik na področju zdravljenja Duchennove mišične distrofije. Z uporabo transpozona Sleeping Beauty so popravili fenotip induciranih pluripotentnih distrofičnih celic, jih diferencirali v skeletno-mišične predniške celice in jih transplantirali nazaj v distrofične miši. Presajene celice so imele biokemijsko obnovljen utrofin-distrofin in izboljšano kontraktilno moč. Celice so se pravilno odzivale na poškodbe in opaziti je bilo razvoj nevro-muskularnih sinaps. Raziskovalci so ubrali avtologen pristop k zdravljenju; ex vivo gensko korekcijo pluripotentnih distrofičnih celic pred transplantacijo. Kar je naprednega pri raziskavi je način manipulacije iPS celic preko indukcije Pax7 ali Pax3 v le-teh. Tovrstno metodo so tudi sami razvili. iPS celice so pripravili z retrovirusno transdukcijo TTF celic. Njihovo pluripotentnost so preverili z imunofluorescenčnim barvanjem ter zmožnostjo celic tvoriti embrionalni mezoderm in vivo. Izbrane celice so imele tipičen kariotip in so bile zmožne tvorbe teratom.

	~~====Popravljenje distrofičnih iPS celic====~~
	Za razliko od večine raziskav Duchennove mišične distrofije so raziskovalci uporabili utrofin-distrofin dKO miši in ne mdx miši, saj fenotip bolezni toliko hujši; hitrejše napredovanje bolezni, abnormalno dihanje, kardiomiopatija in prezgodnja smrt. Takšen fenotip je primerljiv s človeškim.
	Za obnovitev »Z distrofinom povezanega proteinskega kompleksa« so re-ekspresirali µUTRN transgen za katerega je znano, da izboljšuje distrofičen fenotip (nadomešča kompleks utrofin-distrofin) in kot takšen ne izzove imunskega odgovora. Gen so v iPS celice prenesli s Sleeping Beauty sistemom transpozonov, saj omogočajo stabilno ekspresijo v človeških in mišjih celicah. Popravljene iPS celice z µUTRN transgenom so ohranile normalen kariotip.

	~~====Diferenciacija iPS celic v miogene predniške celice====~~
	Da so zagotovili čim boljšo diferenciacijo so v popravljeni celice in tudi v kontrolnih celicah nadzorovano inducirali ekspresijo Pax3, ki izboljšuje rast miogenih predniških celic. Tiste celice, ki so zadostovale določenim parametrom so izpostavili še osnovnemu rastnemu faktorju za fibroblaste ter doksiciklinu. Po dodatku slednjih so se predniške celice začele proliferirati in po in vitro inducirani diferenciacijii so celice vstopile v zadnjo fazo zorenja iz katerih so se razvile več jedrne celice s stabilno ekspresijo µUTRN, kar potrjujejo izvedena imunofluorescenčna mikroskopija, PCR in western blot analiza.

	~~====Regenerativne lastnosti miogenih predniških celic====~~
	Pridobljene celice so seveda morali preizkusiti in vivo, zato so jih vsadili v tri tedne stare dKO miši, v mišico okoli piščali (Tibialis anterior). Po naslednjih treh tednih so izrezali mišico in jo pripravili na analizo, ki je pokazala prisotnost utrofina. In ne samo to, utrofin je bil zmožen obnovitve sistema proteinov, ki so načeloma povezani le z distrofinom. Prav tako ni bilo zaznati prisotnosti tumorjev, saj so predhodno izločili celice, ki so kazale znake za razvoj le-teh.
	~~Regenerativne lastnosti so preverili tudi preko fizioterapevtskih testov, ki so dali naslednje rezultate:~~
	Povečana izometrična tetanična sila mišice, povečana absolutna in specifična sila mišica v primerjavi z distrofično mišico, Ni bilo vidnega izboljšanja na področju utrujenosti mišice; še vedno se utrudi enako hitro ali pa le zanemarljivo malo počasneje kot distrofična mišica.
	~~Še vedno pa niso rešili problema intravenoznega injiciranja, ki je dal mešane rezultate. Kljub temu, miogenih celic niso opazili v drugih tkivih; v srčnem in pljučnem tkivu.~~

	~~==In v prihodnosti ...==~~
	Oblik mišične distrofij je veliko, vendar jih druži skupna lastnost; izguba oziroma nedelovanje distrofina. V primeru, da tega z gensko terapijo ne gre nadomestiti, lahko uporabimo utrofin, kot v primeru Filareto et. al (2013), saj deluje dovolj podobno, da fenotip omili do te mere, da življenje z njim ni več oteženo. Pluripotentne celice na tem področju omogočajo novo obliko terapije, ki ni samo celična, temveč tudi genska, saj jih je lažje manipulirati kot zdrave že diferencirane celice donorske celice. Zagotovo se odpirajo nove možnosti za zdravljenje ne samo mišične distrofije temveč tudi ostalih nevrodegenerativnih bolezni.

UrskaRauter at 21:34, 27 May 2013

2013-05-27T21:34:58Z

← Older revision	Revision as of 21:34, 27 May 2013
Line 1:	Line 1:
		= Kombiniranje tehnologije induciranih pluripotentnih matičnih celic in genskih modifikacij pri zdravljenju mišične distrofije =



		==Mišična distrofija==
		Prvi opisi bolezni segajo v leto 1836, ko sta pojemanje mišične moči opisala Conte in Gioja, vendar sta simptome pripisala tuberkulozi. Gensko pogojenost pa je leta 1852 predvidel Meryon, ki je predpostavil, da se bolezen gensko prenaša preko mame in prizadene predvsem moške potomce.
		Duchennova mišična distrofija je poimenovana po Guillaume Duchennu, francoskem nevrologu, ki je podrobno opisal tovrstno mišično bolezen.
		Duchennova mišična distrofija prizadene kortikospinalni sistem, natančneje sprednje rogove aferentnih nevronov. Posledica je denevracija mišič oziroma oslabljen sistem motoričnih ploščič. Za bolezen je značilna progresivnost, s predela dlani preko udov in kasneje celotnega telesa. V povprečju so za bolezen dovzetnejši moški, od katerih jih je 5-10% bolezen delovalo avtosomno dominantno. Zdravljenje je simptomatično; kombinacija fizioterapije in antiholinergikov.

		===Molekularne osnove Duchennove mišične distrofije (DMD)===
		Razlog, da bolezen v večini prizadene moške je v tem, da je vezana na X kromosom. Incidenca bolezni je ocenjena na 1/3.500 moških (Engel in Banker 1986). Prizadet gen za protein distrofin ima v povprečju 65 eksonov in okoli 2000 kb (Koenig et al. 1987; van Ommen et al. 1987; Burmeister et al. 1988).
		Pravilno zvit protein je velik 427 kDa in ima štiri domene; N-terminalna domeno, paličasto domeno, s cisteinom bogato domeno in C-terminalno domeno (Koenig et al. 1988). Najdemo ga v sarkolemi skeletnih mišic ter na stikih med mišičnimi vlakni in tetivami. Njegova glavna naloge je stabilizacija sarkoleme preko vezave aktina. Prav tako pa so heliksi paličaste domene fleksibilni in elastični kar še dodatno ščiti miofibrile pred mehanskim stresom. Poleg omenjenih funkcij, sodeluje še pri vzpostavitvi stika med sarkolemo in citoskeletom (Rybakova et. al 2000). Glede na posledice ob njegovi odsotnosti, predvidevajo, da ima vlogo tudi v medcelični signalizaciji. Pravilno lahko deluje le v kompleksu s t.i. »Z distrofinom povezanim proteinskim kompleksom« (Davies & Nowak 2006).
		Najpogostejši defekt gena je intragenska delecija (Forrest et al. 1987; Koenig et al. 1987), kar privede do vezave eksonov, ki onemogočajo translacijo na bralnem okvirju. Takšno hipotezo podpira Westrn blot analiza distrofina, ki je nezaznaven pri pacientih z DMD. Podana je bila tudi hipoteza, da do delecije pride že v prvih desetih eksonih (Malhotra et al. 1988). Koenig et al. (1989) so analizirali delecije na večini gena in določili njihove posledice na mRNA ter bralni okvir. Posledice delecije na bralnem okvirju so analizirali preko intron-ekson meje, med tistima dvema eksonoma, ki sta bila ob boku delecije. Določene so bile tri meje glede na njihov položaj v kodirajočem tripletu. Dve od mej sta vodili do delecije, medtem ko je ena ohranila bralni okvir. Ugotovili so, da lahko 92% delecij pojasnijo kot delecije na bralnem okvirju, le 5 delecij pa se je zgodilo že pred vzpostavitvijo bralnega okvira. Takšna oblika delecije je namreč bolj značilna za druge oblike mišične distrofije. Pri DMD tako v povprečju pričakujemo alteracije na regiji bogati s cisteinom ter na C terminalni domeni, ki vodijo v hujše oblike mišične distrofije.

		==Napredki na področju zdravljenja DMD==
		Strategije za zdravljenje DMD lahko razdelimo v štiri kategorije: celična terapija, terapija z zamenjavo genov, supresija nezrelih terminacijskih kodonov in "Preskakovanje eksonov" oziroma v angleščini ''exon skipping''

		V seminarski nalogi se bom usmerila na celično terapijo, vse ostale oblike terapij pa so podrobno opisane '''v viru'''

		Na področju celične terapije je seveda poudarek na uporabi matičnih celic ali pluripotentnih mišičnih celic. Do sedaj je največ uspeha prinesla transplantacija mioblastov v prizadeto (distrofično) tkivo. Mioblasti so se sposobni diferencirati miofibrile, ki so nujne za pravilno delovanje skeletne mišice. Rezultate te transplantacije označujemo za fenomen imenovan »gensko dopolnjevanje«, kar pomeni ekspresijo eksogenih in gostiteljskih genov v mišičnem sinciciju (Watt et al. 1982). Raziskave so nadaljevali na gensko modificiranih mdx miših in zavoljo odličnih rezultatov poizkusili še na ljudeh, vendar je bil izkoristek, žal, prenizek (Mendell et al. 1995). Raziskave na področju transplantacije mioblastov so bile zelo plodne tudi na višjih sesalcih in trenutni trend je raziskovanje optimalnega imunosupresanta, izboljšanje migracije mioblastov ter izračuna optimalnega števila transplantiranih celic. Največja ovira celične terapije je insercija celic, saj se (trenutno) injicirajo le intramuskularno (Partridge, 1991) in ne intravenozno kakor bi bilo zaželeno. Intamuskularno injiciranje otežuje terapijo ne le zaradi nedosegljivosti določenih mišic (npr. difragma), temveč tudi zaradi omejitve diferenciacije mioblastov na posamezna področja v mišici. Do leta 2011 sta bili prijavljeni dve klinični raziskavi na tem področju (Torrente et al. in Guilio Cossu).

		===Kombinacija genetike in pluripotentnih (iPS) celic===

		Leta 2012 so na Univerzi Minessota raziskovalci (Filareto et. al) naredili velik premik na področju zdravljenja Duchennove mišične distrofije. Z uporabo transpozona Sleeping Beauty so popravili fenotip induciranih pluripotentnih distrofičnih celic, jih diferencirali v skeletno-mišične predniške celice in jih transplantirali nazaj v distrofične miši. Presajene celice so imele biokemijsko obnovljen utrofin-distrofin in izboljšano kontraktilno moč. Celice so se pravilno odzivale na poškodbe in opaziti je bilo razvoj nevro-muskularnih sinaps. Raziskovalci so ubrali avtologen pristop k zdravljenju; ex vivo gensko korekcijo pluripotentnih distrofičnih celic pred transplantacijo. Kar je naprednega pri raziskavi je način manipulacije iPS celic preko indukcije Pax7 ali Pax3 v le-teh. Tovrstno metodo so tudi sami razvili. iPS celice so pripravili z retrovirusno transdukcijo TTF celic. Njihovo pluripotentnost so preverili z imunofluorescenčnim barvanjem ter zmožnostjo celic tvoriti embrionalni mezoderm in vivo. Izbrane celice so imele tipičen kariotip in so bile zmožne tvorbe teratom.

		====Popravljenje distrofičnih iPS celic====
		Za razliko od večine raziskav Duchennove mišične distrofije so raziskovalci uporabili utrofin-distrofin dKO miši in ne mdx miši, saj fenotip bolezni toliko hujši; hitrejše napredovanje bolezni, abnormalno dihanje, kardiomiopatija in prezgodnja smrt. Takšen fenotip je primerljiv s človeškim.
		Za obnovitev »Z distrofinom povezanega proteinskega kompleksa« so re-ekspresirali µUTRN transgen za katerega je znano, da izboljšuje distrofičen fenotip (nadomešča kompleks utrofin-distrofin) in kot takšen ne izzove imunskega odgovora. Gen so v iPS celice prenesli s Sleeping Beauty sistemom transpozonov, saj omogočajo stabilno ekspresijo v človeških in mišjih celicah. Popravljene iPS celice z µUTRN transgenom so ohranile normalen kariotip.

		====Diferenciacija iPS celic v miogene predniške celice====
		Da so zagotovili čim boljšo diferenciacijo so v popravljeni celice in tudi v kontrolnih celicah nadzorovano inducirali ekspresijo Pax3, ki izboljšuje rast miogenih predniških celic. Tiste celice, ki so zadostovale določenim parametrom so izpostavili še osnovnemu rastnemu faktorju za fibroblaste ter doksiciklinu. Po dodatku slednjih so se predniške celice začele proliferirati in po in vitro inducirani diferenciacijii so celice vstopile v zadnjo fazo zorenja iz katerih so se razvile več jedrne celice s stabilno ekspresijo µUTRN, kar potrjujejo izvedena imunofluorescenčna mikroskopija, PCR in western blot analiza.

		====Regenerativne lastnosti miogenih predniških celic====
		Pridobljene celice so seveda morali preizkusiti in vivo, zato so jih vsadili v tri tedne stare dKO miši, v mišico okoli piščali (Tibialis anterior). Po naslednjih treh tednih so izrezali mišico in jo pripravili na analizo, ki je pokazala prisotnost utrofina. In ne samo to, utrofin je bil zmožen obnovitve sistema proteinov, ki so načeloma povezani le z distrofinom. Prav tako ni bilo zaznati prisotnosti tumorjev, saj so predhodno izločili celice, ki so kazale znake za razvoj le-teh.
		Regenerativne lastnosti so preverili tudi preko fizioterapevtskih testov, ki so dali naslednje rezultate:
		Povečana izometrična tetanična sila mišice, povečana absolutna in specifična sila mišica v primerjavi z distrofično mišico, Ni bilo vidnega izboljšanja na področju utrujenosti mišice; še vedno se utrudi enako hitro ali pa le zanemarljivo malo počasneje kot distrofična mišica.
		Še vedno pa niso rešili problema intravenoznega injiciranja, ki je dal mešane rezultate. Kljub temu, miogenih celic niso opazili v drugih tkivih; v srčnem in pljučnem tkivu.

		==In v prihodnosti ...==
		Oblik mišične distrofij je veliko, vendar jih druži skupna lastnost; izguba oziroma nedelovanje distrofina. V primeru, da tega z gensko terapijo ne gre nadomestiti, lahko uporabimo utrofin, kot v primeru Filareto et. al (2013), saj deluje dovolj podobno, da fenotip omili do te mere, da življenje z njim ni več oteženo. Pluripotentne celice na tem področju omogočajo novo obliko terapije, ki ni samo celična, temveč tudi genska, saj jih je lažje manipulirati kot zdrave že diferencirane celice donorske celice. Zagotovo se odpirajo nove možnosti za zdravljenje ne samo mišične distrofije temveč tudi ostalih nevrodegenerativnih bolezni.

Lavrencij: Removing all content from page

2013-05-27T21:10:08Z

Removing all content from page

← Older revision		Revision as of 21:10, 27 May 2013
Line 1:		Line 1:




	~~==Uvod==~~
	Z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev (kot najbolj pomembni so se izkazali Oct4 in Sox2 ter Klf4 in c-Myc ali Nanog in Lin28) v somatskih celicah lahko dosežemo reprogramiranje le-teh v tako imenovane inducirane pluripotentne matične celice (ali krajše iPS). Izkazalo se je, da so te celice molekularno in funkcionalno zelo podobne zarodnim matičnim celicam. Velik problem pri reprogramiranju pa predstavlja vključitev virusa (uporabili so retro in lentiviruse – svojo RNA z reverzno transkriptazo prepišejo v cDNA in le-to vključijo v gostiteljsko DNA s pomočjo integraze), s pomočjo katerega dosežemo povečano izražanje potrebnih transkripcijskih faktorjev, v genom naše celice. Največja učinkovitost reprogramacije celic, ki so jo s to metodo uspeli doseči se giblje okoli 0.01-0. 1%. Največji problem predstavlja velika nevarnost za nastanek tumorjev zaradi spontane reaktivacije virusnih transgenov. Tako so si znanstveniki prizadevali, da bi odkrili način priprave iPS brez integracije nevarnih virusov. Za prenos genskega materiala so uporabili adenoviruse in plazmide.
	~~==Načini transformacije==~~
	~~===Adenovirusi===~~
	Gre za srednje velike ikozaedrične dsDNA viruse brez virusne ovojnice, ki so odgovorni predvsem za številne okužbe respiratornega sistema. Genom adenovirusa je velik med 26 in 45 kbp, kar omogoča zapis za 22 do 40 genov. Vstop virusa omogoča interakcija »knob« (gumb) domene na vlaknastem proteinu in celičnim receptorjem (CD46 in CAR). Nato sledi še ena ko-receptorska interakcija, ki omogoči internalizacijo adenovirusa – vstop preko endocitoze. V celici se virus oz. virion sprosti v citoplazmo in se s pomočjo mikrotubulov prenese do jedrne pore. Tam se virusna DNA sprosti in vstopi v jedro ter se poveže s histoni. Replikacija poteka v jedru gostiteljske celice s pomočjo replikacijskega sistema gostiteljske celice. Primarni transkript je razrezan na mRNA-je, ki so kompatibilni z gostiteljskimi ribosomi, kar omogoča nadaljno translacijo in sintezo proteinov. Ko so virusne komponente uspešno replicirane, se virus sprosti iz celice.

	Z uporabo adenovirusov, za reprogramiranje celic, se uspemo izogniti integraciji večjih virusnih DNA fragmentov. Vendar je v primerjavi z retrovirusno metodo, ta postopek približno 1000-krat manj učinkovit, kar pomeni da je učinkovitost okoli 0.0001-0.001%, zato potekajo nadaljne raziskave, da bi odkrili ali lahko s spremenjenimi pogoji (različni substrati ali fizikalnimi pogoji) povečamo izkoristek metode.

	~~===Uporaba plazmidnih vektorjev===~~
	Transfekcija plazmidov, ki vsebujejo cDNA željenih transkripcijskih faktorjev, se je izkazala kot obetajoča metoda, saj ni moč zaznati vključitve plazmidov. Plazmid je majhna DNA molekula, ki se replicira neodvisno od kromosomske DNA. Uporaben je za vnos tuje DNA v celico, kjer se le-ta replicira. Tako lahko dodatno izražamo željene proteine.

	Za pripravo multicistronskih vektorjev uporabimo kratke (18-22 AK) 2A peptidne sekvence. Te omogočajo stehiometrično sintezo večih proteinov znotraj istega vektorja, ker imajo divergentne amino-terminalne sekvence. To zelo zmanjša možnosti za homologno rekombinacijo in omogoča porabo večih 2A peptidnih sekvenc znotraj istega vektorja. Geni, ki so med temi 2A sekvencami, so popolnoma ločeni.Takšno povezavo med 2A peptidno sekvenco in vektorjem na kratko imenujem tudi reprogamska »kaseta« (»reprograming cassette«). Z uporabo piggyBac transpozona (PB transposon delivery system) so uspeli vektor specifično vgraditi v gostiteljsko DNA, kar dodatno zmanjša vpliv integracije vektorja na genom. V vektorju so uporabili tudi CAG promotor, ki je manj podvržen utišanju. Tako so dosegli relativno visoko stopnjo učinkovitosti pri reprogramiranju. Odstranitev zunanjih faktorjev s Cre rekombinazo ne vpliva na vzdrževanje iPS stanja. Integriran vektor lahko odstranimo s pomočjo PB transpozona. Izmerjena učinkovitost metode je večja od obeh prej omenjenih metod in znaša približno 2.5%.

	~~===piggyBac trnaspozon===~~

	Je mobilen gentski element, ki učinkovito »transpozira« oz. se prenaša med vektorji in kromosomi z t.i. »reže in lepi« mehanizmom ("cut and paste" mechanism). Med transpozicijo, PB transpozaze prepoznajo transposon-specifična invertna terminalna ponovitvena zaporedija (ITRs), ki se nahajajo na koncih transpozonskega vektorja. Tako se transpozonski vektor učinkovito prenese iz izvirnega mesta v TTAA kromosomska mesta. Hkrati je možna tudi odstranitev transpozona s kromosoma.

	~~===Cre rekombinaza===~~
	Gre za encim iz družine integraz, ki nadzira speceifične rekombinacije, s pomočjo mehanizma topoizomeraze I . S pomočjo rekombinaze lahko modificiramo (insercije, delecije, translokacije) DNA. Omogoča integracijo željenih vektorjev in kasneje njihovo odstranitev.
	~~==Potek dela raziskave ==~~
	Za razvoj pluripotentnosti v celicah je potrebno izraziti nekatere transkripcijske faktorje. Raziskovalci so klonirali cDNA Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 ter jih vnesli v replikacijsko nesposobne adenovirusne vektorje s pomočjo človeškega citomegalovirusnega zgodnjega promotorja. Poskusi, da bi reprogramirali fibroblaste mišjega repa so bili neuspešni, domnevno zaradi razredčitve sintetiziranih proteinov (iz celice).
	~~===Jetrne celice===~~
	Za naslednje poskuse so uporabili mišje jetrne celice, ki v prisotnosti doksiciklina izražajo Oct4 in za reprogramiranje potrebujejo manjše število virusnih delcev kot pa fibroblasti. Okužili so ~500,000 Oct4 mišjih jetrnih celic z adenovirusi, ki so izražali Sox4, Klf4 in c-Myc (razmerje med številom virusov in celic je bilo 20 do 50). 20 – 30 % vseh celic je izražalo vse tri transkripcijske faktorje. 9 kolonij, podobnih iPS celicam je bilo vidnih na gojišču po 24 – 30 dnevni inkubaciji v prisotnosti doksiciklina. Celice so nadalje rasle tudi brez doksiciklina, kar je pokazalo, da transgeno izražanje Oct4 ni bilo več potrebno.
	~~===Fibroblasti===~~
	Po enakem postopku so ponovno poskusili pripraviti iPS celice repnih fibroblastov. Uporabili so fibroblaste, ki v prosotnosti doksiciklina izražajo Oct4 konjugiran z zelenim fluorescenčnim proteinom (GFP). Po inkubaciji 1,000,000 celic je ostala ena GFP+ kolonija, ki je porasla v stabilno celično linijo.

	Da bi ugotovili ali lahko transformirajo celice tudi brez transgenega izražanja Oct4, so inkubirali mišje jetrne celice transfecirane z Oct4-GFP (zaradi nizkega razmerja med številom jetrnih celic in virusov, ki privede do okužbe) z virusi, ki so nosili zapis za vse štiri proteine. 60 % vseh celic je izražalo vse štiri faktorje. Pridobili so tri kolonije, ki so jih razširili v stabilne celične linije.

	S qPCR reakcijo so preverili ali adeno-iPS celice izkazujejo pluripotentnost tudi na molekulskem nivoju. Ekspresijska analiza endogenih markerjev za pluripotentnost se ni razlikovala od embrionalnih matičnih celic (ES). Zaznana je bila tudi demetilacija promotorjev Oct4 in Nanog v enaki meri, kot je to značilno za ES.
	Znano je, da se lahko adenovirusni vektorji v zelo majhni meri inkorporirajo v gostiteljsko DNA. Da bi izključili možnost stalne vključitve virusne DNA, so naredili PCR reakcijo z začetnimi oligonukleotudi, ki prepoznajo virusne dele DNA. Signala, ki bi nakazoval prisotnost take DNA niso zaznali. S tehniko prenos »Southern« so poskušali ugotoviti prisotnost eksogenih virusnih zaporedij, ki jih pravtako ni bilo mogoče zaznati.
	~~===Razvojna učinkovitost===~~
	Da bi dokazali razvojno učinkovitost adeno-iPS celic so jih vnesli v SCID miši. Vse testirane celične linije so po 3-4 tednih proizvedle teratome, ki so po histološkem testiranju pokazale diferenciacijo v specifičo tkivo. Odrasli samci, vzgojeni iz FL-9 in TTF-1 adeno-iPS celic so zaplodili potomce, ki so imeli za adeno-iPS celice specifično barvo dlake (agouti).

	~~==Zaključek==~~

	Za indukcijo nastanka pluripotentnih celic, so nam trenutno navoljo tri preizkušene tehnike. Prva, ki se je izkazala za uspešno je temeljila na integraciji inducirajočih faktorjev v DNA gostiteljske celice s pomočjo retrovirusov. Metoda ima učinkovitost v območju 0.01-0.1%. Vendar se je kljub temu izkazala za neprimerno, saj vgrajena virusna DNA močno poveča tvegneje za tumorogenezo.

	Druga metoda je za vnos genov inducirajočih faktorjev uporabila adenoviruse, ki svoje DNA ne vgrajujejo v gostiteljsko DNA. Vendar ima tudi ta metoda pomankljivosti, saj je potrebno celice konstantno spirati z raztopino virusov, preden se te uspejo petvoriti v pluripotentne. Celice razičnih tkiv so različno občutljive na virusno infekcijo in kljub temu, da adenovirusi ne vgrajujejo lastne DNA v gostiteljsko, le tega niso uspeli popolnoma potrditi. Dodatna pomankljivost metode je njen nizek izkoristek, ki znaša komaj 0.0001-0.001%.

	Zadnja metoda uporablja t.i. reprogramsko kaseto, ki jo sestavljata 2A peptidna sekvenca in vektor, dodatno pa se uporabita še piggyBac transpozon in Cre rekombinaza. Slednja skrbita za odstranitev vektorske DNA iz gostiteljske DNA in tako močno zmanjšata vpliv metode na genom. Takšen način reprogramiranja je zelo obetaven, saj minimira vpliv postopka na genom in ima največji izkoristek izmed vseh treh metod (2.5 %).
	Kljub temu, da ima metoda reprogramske kasete najvišji izkoristek, je bilo izvedenih še premalo raziskav, da bi lahko zagotovo trdili, da je izmerjeni izkoristek tudi realen, saj na učinkovitost metode lahko vpliva več faktorjev, ki še niso določeni.

	~~Tako je trenutno najbolj zanesljiva metoda uporaba adenovirusov, saj so raziskave že potrdile njeno zanesljivo učinkovitost in uporabnost ter zanemarljiv vpliv na genom reprogramirane celice.~~

	~~==Viri:==~~
	~~- Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science, 2008, letn. 322, str. 945-949.~~

	~~- Okita K. in sod. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008, letn. 322, str. 949-953.~~

	~~- Kaji K. in sod. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reporgramming factors. Nature, 2009, letn. 458, str. 771-776.~~

	- Edilamar Menezes Oliveira and M Ian Phillips (2011). Associated Adeno Virus Vector for Producing Induced Pluripotent Stem Cells (IPS) for Human Somatic Cells, Stem Cells in Clinic and Research, Dr. Ali Gholamrezanezhad (Ed.), ISBN: 978-953-307-797-0, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/stem-cells-in-clinic-and-research/associated-adeno-virus-vector-forproducing-induced-pluripotent-stem-cells-ips-for-human-somatic-cel

	- Szymczak L. A. in sod. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide–based retroviral vector. Nature biotechnology, 2004, letn. 22, str. 589 – 594.

	~~- Wikipedija, prosta enciklopedija [online], Vector (molecular biology) [18. 5. 2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Vector_%28molecular_biology%29;~~

	~~- Cre-Lox recombination [16.5.2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_Recombination;~~

	~~- Adenoviridae [18. 5. 2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Adenoviruses~~

Lavrencij at 19:34, 27 May 2013

2013-05-27T19:34:02Z

← Older revision		Revision as of 19:34, 27 May 2013
Line 58:		Line 58:
	- Szymczak L. A. in sod. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide–based retroviral vector. Nature biotechnology, 2004, letn. 22, str. 589 – 594.		- Szymczak L. A. in sod. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide–based retroviral vector. Nature biotechnology, 2004, letn. 22, str. 589 – 594.

	- Wikipedija, prosta enciklopedija [online], Vector (molecular biology) [18. 5. 2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Vector_%28molecular_biology%29; Cre-Lox recombination [16.5.2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_Recombination; Adenoviridae [18. 5. 2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Adenoviruses		- Wikipedija, prosta enciklopedija [online], Vector (molecular biology) [18. 5. 2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Vector_%28molecular_biology%29;

			- Cre-Lox recombination [16.5.2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_Recombination;

			- Adenoviridae [18. 5. 2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Adenoviruses

Lavrencij: New page: ...

2013-05-27T19:30:33Z

New page: ...

New page

==Uvod==
Z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev (kot najbolj pomembni so se izkazali Oct4 in Sox2 ter Klf4 in c-Myc ali Nanog in Lin28) v somatskih celicah lahko dosežemo reprogramiranje le-teh v tako imenovane inducirane pluripotentne matične celice (ali krajše iPS). Izkazalo se je, da so te celice molekularno in funkcionalno zelo podobne zarodnim matičnim celicam. Velik problem pri reprogramiranju pa predstavlja vključitev virusa (uporabili so retro in lentiviruse – svojo RNA z reverzno transkriptazo prepišejo v cDNA in le-to vključijo v gostiteljsko DNA s pomočjo integraze), s pomočjo katerega dosežemo povečano izražanje potrebnih transkripcijskih faktorjev, v genom naše celice. Največja učinkovitost reprogramacije celic, ki so jo s to metodo uspeli doseči se giblje okoli 0.01-0. 1%. Največji problem predstavlja velika nevarnost za nastanek tumorjev zaradi spontane reaktivacije virusnih transgenov. Tako so si znanstveniki prizadevali, da bi odkrili način priprave iPS brez integracije nevarnih virusov. Za prenos genskega materiala so uporabili adenoviruse in plazmide.
==Načini transformacije==
===Adenovirusi===
Gre za srednje velike ikozaedrične dsDNA viruse brez virusne ovojnice, ki so odgovorni predvsem za številne okužbe respiratornega sistema. Genom adenovirusa je velik med 26 in 45 kbp, kar omogoča zapis za 22 do 40 genov. Vstop virusa omogoča interakcija »knob« (gumb) domene na vlaknastem proteinu in celičnim receptorjem (CD46 in CAR). Nato sledi še ena ko-receptorska interakcija, ki omogoči internalizacijo adenovirusa – vstop preko endocitoze. V celici se virus oz. virion sprosti v citoplazmo in se s pomočjo mikrotubulov prenese do jedrne pore. Tam se virusna DNA sprosti in vstopi v jedro ter se poveže s histoni. Replikacija poteka v jedru gostiteljske celice s pomočjo replikacijskega sistema gostiteljske celice. Primarni transkript je razrezan na mRNA-je, ki so kompatibilni z gostiteljskimi ribosomi, kar omogoča nadaljno translacijo in sintezo proteinov. Ko so virusne komponente uspešno replicirane, se virus sprosti iz celice.

Z uporabo adenovirusov, za reprogramiranje celic, se uspemo izogniti integraciji večjih virusnih DNA fragmentov. Vendar je v primerjavi z retrovirusno metodo, ta postopek približno 1000-krat manj učinkovit, kar pomeni da je učinkovitost okoli 0.0001-0.001%, zato potekajo nadaljne raziskave, da bi odkrili ali lahko s spremenjenimi pogoji (različni substrati ali fizikalnimi pogoji) povečamo izkoristek metode.

===Uporaba plazmidnih vektorjev===
Transfekcija plazmidov, ki vsebujejo cDNA željenih transkripcijskih faktorjev, se je izkazala kot obetajoča metoda, saj ni moč zaznati vključitve plazmidov. Plazmid je majhna DNA molekula, ki se replicira neodvisno od kromosomske DNA. Uporaben je za vnos tuje DNA v celico, kjer se le-ta replicira. Tako lahko dodatno izražamo željene proteine.

Za pripravo multicistronskih vektorjev uporabimo kratke (18-22 AK) 2A peptidne sekvence. Te omogočajo stehiometrično sintezo večih proteinov znotraj istega vektorja, ker imajo divergentne amino-terminalne sekvence. To zelo zmanjša možnosti za homologno rekombinacijo in omogoča porabo večih 2A peptidnih sekvenc znotraj istega vektorja. Geni, ki so med temi 2A sekvencami, so popolnoma ločeni.Takšno povezavo med 2A peptidno sekvenco in vektorjem na kratko imenujem tudi reprogamska »kaseta« (»reprograming cassette«). Z uporabo piggyBac transpozona (PB transposon delivery system) so uspeli vektor specifično vgraditi v gostiteljsko DNA, kar dodatno zmanjša vpliv integracije vektorja na genom. V vektorju so uporabili tudi CAG promotor, ki je manj podvržen utišanju. Tako so dosegli relativno visoko stopnjo učinkovitosti pri reprogramiranju. Odstranitev zunanjih faktorjev s Cre rekombinazo ne vpliva na vzdrževanje iPS stanja. Integriran vektor lahko odstranimo s pomočjo PB transpozona. Izmerjena učinkovitost metode je večja od obeh prej omenjenih metod in znaša približno 2.5%.

===piggyBac trnaspozon===

Je mobilen gentski element, ki učinkovito »transpozira« oz. se prenaša med vektorji in kromosomi z t.i. »reže in lepi« mehanizmom ("cut and paste" mechanism). Med transpozicijo, PB transpozaze prepoznajo transposon-specifična invertna terminalna ponovitvena zaporedija (ITRs), ki se nahajajo na koncih transpozonskega vektorja. Tako se transpozonski vektor učinkovito prenese iz izvirnega mesta v TTAA kromosomska mesta. Hkrati je možna tudi odstranitev transpozona s kromosoma.

===Cre rekombinaza===
Gre za encim iz družine integraz, ki nadzira speceifične rekombinacije, s pomočjo mehanizma topoizomeraze I . S pomočjo rekombinaze lahko modificiramo (insercije, delecije, translokacije) DNA. Omogoča integracijo željenih vektorjev in kasneje njihovo odstranitev.
==Potek dela raziskave ==
Za razvoj pluripotentnosti v celicah je potrebno izraziti nekatere transkripcijske faktorje. Raziskovalci so klonirali cDNA Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 ter jih vnesli v replikacijsko nesposobne adenovirusne vektorje s pomočjo človeškega citomegalovirusnega zgodnjega promotorja. Poskusi, da bi reprogramirali fibroblaste mišjega repa so bili neuspešni, domnevno zaradi razredčitve sintetiziranih proteinov (iz celice).
===Jetrne celice===
Za naslednje poskuse so uporabili mišje jetrne celice, ki v prisotnosti doksiciklina izražajo Oct4 in za reprogramiranje potrebujejo manjše število virusnih delcev kot pa fibroblasti. Okužili so ~500,000 Oct4 mišjih jetrnih celic z adenovirusi, ki so izražali Sox4, Klf4 in c-Myc (razmerje med številom virusov in celic je bilo 20 do 50). 20 – 30 % vseh celic je izražalo vse tri transkripcijske faktorje. 9 kolonij, podobnih iPS celicam je bilo vidnih na gojišču po 24 – 30 dnevni inkubaciji v prisotnosti doksiciklina. Celice so nadalje rasle tudi brez doksiciklina, kar je pokazalo, da transgeno izražanje Oct4 ni bilo več potrebno.
===Fibroblasti===
Po enakem postopku so ponovno poskusili pripraviti iPS celice repnih fibroblastov. Uporabili so fibroblaste, ki v prosotnosti doksiciklina izražajo Oct4 konjugiran z zelenim fluorescenčnim proteinom (GFP). Po inkubaciji 1,000,000 celic je ostala ena GFP+ kolonija, ki je porasla v stabilno celično linijo.

Da bi ugotovili ali lahko transformirajo celice tudi brez transgenega izražanja Oct4, so inkubirali mišje jetrne celice transfecirane z Oct4-GFP (zaradi nizkega razmerja med številom jetrnih celic in virusov, ki privede do okužbe) z virusi, ki so nosili zapis za vse štiri proteine. 60 % vseh celic je izražalo vse štiri faktorje. Pridobili so tri kolonije, ki so jih razširili v stabilne celične linije.

S qPCR reakcijo so preverili ali adeno-iPS celice izkazujejo pluripotentnost tudi na molekulskem nivoju. Ekspresijska analiza endogenih markerjev za pluripotentnost se ni razlikovala od embrionalnih matičnih celic (ES). Zaznana je bila tudi demetilacija promotorjev Oct4 in Nanog v enaki meri, kot je to značilno za ES.
Znano je, da se lahko adenovirusni vektorji v zelo majhni meri inkorporirajo v gostiteljsko DNA. Da bi izključili možnost stalne vključitve virusne DNA, so naredili PCR reakcijo z začetnimi oligonukleotudi, ki prepoznajo virusne dele DNA. Signala, ki bi nakazoval prisotnost take DNA niso zaznali. S tehniko prenos »Southern« so poskušali ugotoviti prisotnost eksogenih virusnih zaporedij, ki jih pravtako ni bilo mogoče zaznati.
===Razvojna učinkovitost===
Da bi dokazali razvojno učinkovitost adeno-iPS celic so jih vnesli v SCID miši. Vse testirane celične linije so po 3-4 tednih proizvedle teratome, ki so po histološkem testiranju pokazale diferenciacijo v specifičo tkivo. Odrasli samci, vzgojeni iz FL-9 in TTF-1 adeno-iPS celic so zaplodili potomce, ki so imeli za adeno-iPS celice specifično barvo dlake (agouti).

==Zaključek==

Za indukcijo nastanka pluripotentnih celic, so nam trenutno navoljo tri preizkušene tehnike. Prva, ki se je izkazala za uspešno je temeljila na integraciji inducirajočih faktorjev v DNA gostiteljske celice s pomočjo retrovirusov. Metoda ima učinkovitost v območju 0.01-0.1%. Vendar se je kljub temu izkazala za neprimerno, saj vgrajena virusna DNA močno poveča tvegneje za tumorogenezo.

Druga metoda je za vnos genov inducirajočih faktorjev uporabila adenoviruse, ki svoje DNA ne vgrajujejo v gostiteljsko DNA. Vendar ima tudi ta metoda pomankljivosti, saj je potrebno celice konstantno spirati z raztopino virusov, preden se te uspejo petvoriti v pluripotentne. Celice razičnih tkiv so različno občutljive na virusno infekcijo in kljub temu, da adenovirusi ne vgrajujejo lastne DNA v gostiteljsko, le tega niso uspeli popolnoma potrditi. Dodatna pomankljivost metode je njen nizek izkoristek, ki znaša komaj 0.0001-0.001%.

Zadnja metoda uporablja t.i. reprogramsko kaseto, ki jo sestavljata 2A peptidna sekvenca in vektor, dodatno pa se uporabita še piggyBac transpozon in Cre rekombinaza. Slednja skrbita za odstranitev vektorske DNA iz gostiteljske DNA in tako močno zmanjšata vpliv metode na genom. Takšen način reprogramiranja je zelo obetaven, saj minimira vpliv postopka na genom in ima največji izkoristek izmed vseh treh metod (2.5 %).
Kljub temu, da ima metoda reprogramske kasete najvišji izkoristek, je bilo izvedenih še premalo raziskav, da bi lahko zagotovo trdili, da je izmerjeni izkoristek tudi realen, saj na učinkovitost metode lahko vpliva več faktorjev, ki še niso določeni.

Tako je trenutno najbolj zanesljiva metoda uporaba adenovirusov, saj so raziskave že potrdile njeno zanesljivo učinkovitost in uporabnost ter zanemarljiv vpliv na genom reprogramirane celice.

==Viri:==
- Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science, 2008, letn. 322, str. 945-949.

- Okita K. in sod. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008, letn. 322, str. 949-953.

- Kaji K. in sod. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reporgramming factors. Nature, 2009, letn. 458, str. 771-776.

- Edilamar Menezes Oliveira and M Ian Phillips (2011). Associated Adeno Virus Vector for Producing Induced Pluripotent Stem Cells (IPS) for Human Somatic Cells, Stem Cells in Clinic and Research, Dr. Ali Gholamrezanezhad (Ed.), ISBN: 978-953-307-797-0, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/stem-cells-in-clinic-and-research/associated-adeno-virus-vector-forproducing-induced-pluripotent-stem-cells-ips-for-human-somatic-cel

- Szymczak L. A. in sod. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide–based retroviral vector. Nature biotechnology, 2004, letn. 22, str. 589 – 594.

- Wikipedija, prosta enciklopedija [online], Vector (molecular biology) [18. 5. 2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Vector_%28molecular_biology%29; Cre-Lox recombination [16.5.2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_Recombination; Adenoviridae [18. 5. 2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Adenoviruses