The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo - Revision history

D.Armic at 17:57, 10 April 2021

2021-04-10T17:57:05Z

D.Armic at 17:40, 10 April 2021

2021-04-10T17:40:46Z

@@ Line 1: / Line 1: @@
-The Chlamy Cleaner [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši projekt na področju rastlinske sintezne biologije. Avtorji projekta so študentje Univerze Sorbonna v Parizu.
+The Chlamy Cleaner [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši projekt na področju rastlinske sintezne biologije. Avtorji projekta so študentje Univerze Sorbonne v Parizu.
 Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Sorbonne_U_Paris https://2020.igem.org/Team:Sorbonne_U_Paris]
@@ Line 58: / Line 58: @@
 V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.
-{| class="wikitable"
-|+ ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. Vsi biološki deli so bili pripravljeni v skladu s standardom MoClo za'' C. reinhardtii.
+{|
 |-
-! KODA BIOLOŠKEGA DELA !! OPIS BIOLOŠKEGA DELA
+| '''KODA BIOLOŠKEGA DELA''' || '''OPIS BIOLOŠKEGA DELA'''
 |-
 | BBa_K3373001 || CDS gena ''atzA'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
@@ Line 73: / Line 74: @@
 | BBa_K3373005 || CDS gena za protein UVR-8 iz ''A. thaliana'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
 |-
 |}
 == Viri ==

D.Armic at 17:03, 10 April 2021

2021-04-10T17:03:06Z

@@ Line 62: / Line 62: @@
 |-
 ! KODA BIOLOŠKEGA DELA !! OPIS BIOLOŠKEGA DELA
-|--
+|-
 | BBa_K3373001 || CDS gena ''atzA'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
 |-
@@ Line 74: / Line 74: @@
 |-
 |}

D.Armic: New page: The Chlamy Cleaner [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši projekt na področju rastlinske sintezne biologije. Avtorji projekta so študentje Univ...

2021-04-10T17:00:46Z

New page: The Chlamy Cleaner [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši projekt na področju rastlinske sintezne biologije. Avtorji projekta so študentje Univ...

New page

The Chlamy Cleaner [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši projekt na področju rastlinske sintezne biologije. Avtorji projekta so študentje Univerze Sorbonna v Parizu.

Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Sorbonne_U_Paris https://2020.igem.org/Team:Sorbonne_U_Paris]

== Onesnaženje reke Sene ==
Sena je reka, ki teče skozi Pariz. Vanjo se izteka veliko odpadnih vod iz gospodinjstev in kmetijstva, zato se sooča z velikim onesnaženjem. Čeprav je danes na reki postavljenih že več čistilnih naprav, le-te ne morejo odstraniti nekaterih mikroonesnaževalcev, kot so antibiotiki, sintetični hormoni in pesticidi [2].

=== Atrazin ===
Analize vode v reki Seni so pokazale, da je prisotno močno onesnaženje z atrazinom in njegovimi razgradnimi produkti (dietil atrazin, dezizopropil atrazin).

Atrazin je triazinski herbicid, ki je bil včasih zelo pogosto uporabljen za odstranjevanje plevela [3]. Deluje kot inhibitor fotosistema II in prepreči vezavo plastokinona B [4]. Posledica tega je prekinitev elektronske transportne verige in s tem tudi fotosinteze. Atrazin predstavlja veliko tveganje za človeka in okolje, zato je od leta 2003 njegova uporaba v Evropski uniji prepovedana [3]. Kljub njegovi prepovedi pa je veliko atrazina še vedno prisotnega v vodi, saj je zelo stabilen (njegova razpolovna doba v vodi je več let – lahko tudi do 14 let) [5].

== Projekt The Chlamy Cleaner ==
=== Ideja ===
Ideja projekta The Chlamy Cleaner je bila rešiti problematiko onesnaženja reke Sene z atrazinom s pomočjo filtra iz alg, ki bi ta herbicid razgradile. Kot šasijo so izbrali zeleno algo ''Chlamydomonas reinhardtii'', saj ima le-ta že sama po sebi dobro sposobnost bioremediacije. Lahko namreč razgradi antibiotike, hormone in druge farmacevtske spojine, npr. naravne in sintezne estrogene ter antibiotike azitromicin, ciprofloksacin in sulfapiridin [6]. Sposobnost alge za bioremediacijo pa so želeli še izboljšati z vnosom sposobnosti za razgradnjo atrazina.

Projekt je bil sestavljen iz dveh delov:

* vnos metabolne poti za razgradnjo atrazina v ''C. reinhardtii'',

* vnos samomorilskega stikala v ''C. reinhardtii''.

=== Metabolna pot razgradnje atrazina ===
Atrazin je organska molekula, ki so jo sposobni razgraditi nekateri mikroorganizmi, med katerimi je tudi ''Pseudomonas''. Bakterija ''Pseudomonas sp.'' ima v svojem genomu šest genov (''atzA'', ''atzB'', ''atzC'', ''atzD'', ''atzE'' in ''atzF''), ki zapisujejo za encime metabolne poti razgradnje atrazina do ogljikovega dioksida in amonijaka [7].

Vnos celotne metabolne poti v ''C. reinhardtii'' bi bil zahteven, zato se je skupina odločila v algi izraziti le prve tri encime te metabolne poti. Gre za encime atrazin klorohidrolaza (atzA), hidroksiatrazin etilaminohidrolaza (atzB) in N-izopropilamelid izopropil amidohidrolaza (atzC). Razgradnja poteka tako, da najprej encim atzA pretvori atrazin v hidroksiatrazin, nato encim atzB odcepi etilamin, da nastane N-izopropilamelid, na koncu pa še encim atzC katalizira nastanek cianurne kisline in izopropilamina. Končni produkt poti je torej cianurna kislina, ki je bistveno manj toksična spojina kot sam atrazin.

Pripravili so plazmid, ki je vseboval gene ''atzA'', ''atzB'' in ''atzC'' iz seva ''ADP'' bakterije ''Pseudomonas sp.'', pri čemer so optimizirali rabo kodona za ''C. reinhardtii''. Uporabili so t.i. metodo Golden Gate Modular Cloning (MoClo) za ''C. reinhardtii'' [8]. Metoda temelji na uporabi restriktaz tipa IIS ''Bbs''I in ''Bsa''I. Postopek kloniranja je bil razdeljen na tri nivoje:

* nivo 0: vnos osnovnih bioloških delov preko restrikcijskih mest ''Bbs''I,

* nivo 1: združevanje osnovnih bioloških delov v transkripcijske enote preko restrikcijskih mest ''Bsa''I,

* nivo M: združevanje transkripcijskih enot v končne konstrukte preko restrikcijskih mest ''Bbs''I.

Celoten postopek kloniranja z metodo Golden Gate Modular Cloning je prikazan na tej [https://2020.igem.org/wiki/images/1/16/T--Sorbonne_U_Paris--MoClo.png sliki]. V projektu pa so uporabili prilagojeno metodo za ''C. reinhardtti'', ki se od klasičnega postopka razlikuje v uporabi restriktaze ''Bbs''I namesto ''Bpi''I.

=== Samomorilsko stikalo ===
Ker gre za gensko spremenjen organizem, je morala skupina poskrbeti tudi za varnost, če bi se alga razširila v naravo. Zato so poleg nove metabolne poti za ''C. reinhardtii'' pripravili še samomorilsko stikalo. Gre za apoptozno napravo, ki bi sprožila programirano celično smrt ob prisotnosti UV-svetlobe.

Kot efektorski protein, ki bi sprožil celično smrt, so uporabili nukleazo iz bakterije ''Staphylococcus aureus''. Le-ta bi povzročila fragmentacijo DNA, kar bi sprožilo programirano celično smrt ''C. reinhardtii''. Aktivnost nukleaze mora biti natančno regulirana, da pride do celične smrti le, ko alga uide v naravo. Zato so nukleazo modificirali tako, da so ji dodali prepoznavno mesto za proteazo TEV in transmembransko sidro. Nukleaza bi bila torej vsidrana v membrano, dokler je ne bi sprostila proteaza TEV. Poleg tega so nukleazi dodali še jedrni lokalizacijski signal (NLS), ki bi omogočil njeno potovanje v jedro, kjer bi fragmentirala DNA.

Aktivnost proteaze TEV pa je regulirana s prisotnostjo oz. odsotnostjo UV-svetlobe. Zapis za proteazo TEV so razdelili na dva dela; N-konec so fuzirali s proteinom COP1, C-konec pa s proteinom UVR-8. V prisotnosti UV-svetlobe proteina COP1 in UVR-8 heterodimerizirata, zato se proteaza TEV sestavi, postane aktivna in sprosti nukleazo iz membrane.

Filter, v katerem so bodo nahajale alge, mora biti narejen tako, da ne prepušča UV-svetlobe. Celice znotraj filtra torej preživijo, ker proteina COP1 in UVR-8 ne dimerizirata in proteaza TEV ostane neaktivna. Če pa bi alga ''C. reihnardtii'' ušla iz filtra, bi postala izpostavljena UV-svetlobi, kar bi aktiviralo proteazo TEV in posledično tudi nukleazo, ki bi sprožila programirano celično smrt.

Pripravili so plazmid, ki je vseboval tri konstrukte:

* zapis za nukleazo iz bakterije ''Staphylococcus aureus'' z dodanim NLS iz virusa SV-40, prepoznavnim mestom za proteazo TEV, transmembransko domeno proteina HAPLESS2 iz ''C. reinhardtii'' in signalnim peptidom karbonske anhidraze 1 iz ''C. reinhardtii'',

* zapis za fuzijski protein N-končnega dela proteze TEV in proteina COP1 iz ''Arabidopsis thaliana'', med katerima je povezovalec GSAT,

* zapis za fuzijski protein C-končnega dela proteaze TEV in proteina URV-8 iz ''Arabidopsis thaliana'', med katerima je povezovalec GSAT.

=== Laboratorijsko delo in rezultati ===
Zaradi pandemije COVID-19 je imela skupina omejen dostop do laboratorija, zato jim ni uspelo narediti vsega, kar so načrtovali. Uspeli so pripraviti plazmida za razgradnjo atrazina in samomorilsko stikalo ter testirati toksičnost atrazina in cianurne kisline za ''C. reinhardtii''. Ni pa jim uspelo transformirati celic ''C. reinhardtii'' s tema plazmidoma ter testirati izražanja in funkcionalnosti konstruktov.

V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.

{| class="wikitable"
|+ ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. Vsi biološki deli so bili pripravljeni v skladu s standardom MoClo za'' C. reinhardtii.
|-
! KODA BIOLOŠKEGA DELA !! OPIS BIOLOŠKEGA DELA
|--
| BBa_K3373001 || CDS gena ''atzA'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
|-
| BBa_K3373002 || CDS gena ''atzB'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
|-
| BBa_K3373003 || CDS gena ''atzC'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
|-
| BBa_K3373004 || CDS gena za protein COP1 iz ''A. thaliana'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
|-
| BBa_K3373005 || CDS gena za protein UVR-8 iz ''A. thaliana'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
|-
|}

← Older revision		Revision as of 17:57, 10 April 2021
Line 62:		Line 62:
	\|+ style="text-align: left;" \| ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. Vsi biološki deli so bili pripravljeni v skladu s standardom MoClo za'' C. reinhardtii.		\|+ style="text-align: left;" \| ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. Vsi biološki deli so bili pripravljeni v skladu s standardom MoClo za'' C. reinhardtii.
	\|-		\|-
	\| '''KODA ~~BIOLOŠKEGA DELA~~''' \|\| '''OPIS BIOLOŠKEGA DELA'''		\| '''KODA''' \|\| '''OPIS BIOLOŠKEGA DELA'''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373001 \|\| CDS gena ''atzA'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373001 BBa_K3373001] \|\| CDS gena ''atzA'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373002 \|\| CDS gena ''atzB'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373002 BBa_K3373002] \|\| CDS gena ''atzB'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373003 \|\| CDS gena ''atzC'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373003 BBa_K3373003] \|\| CDS gena ''atzC'' iz ''Pseudomonas sp. ADP'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373004 \|\| CDS gena za protein COP1 iz ''A. thaliana'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373004 BBa_K3373004] \|\| CDS gena za protein COP1 iz ''A. thaliana'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373005 \|\| CDS gena za protein UVR-8 iz ''A. thaliana'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373005 BBa_K3373005] \|\| CDS gena za protein UVR-8 iz ''A. thaliana'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373006 \|\| CDS povezovalca GSAT z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373006 BBa_K3373006] \|\| CDS povezovalca GSAT z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373007 \|\| CDS transmembranske domene proteina HAPLESS2 iz ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373007 BBa_K3373007] \|\| CDS transmembranske domene proteina HAPLESS2 iz ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373008 \|\| CDS gena za nukleazo iz ''S. aureus'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373008 BBa_K3373008] \|\| CDS gena za nukleazo iz ''S. aureus'' z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373009 \|\| CDS N-končnega dela gena za proteazo TEV z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373009 BBa_K3373009] \|\| CDS N-končnega dela gena za proteazo TEV z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373010 \|\| CDS C-končnega dela gena za proteazo TEV z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373010 BBa_K3373010] \|\| CDS C-končnega dela gena za proteazo TEV z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373011 \|\| CDS fuzijskega gena med povezovalcem GSAT in prepoznavnim mestom za proteazo TEV z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373011 BBa_K3373011] \|\| CDS fuzijskega gena med povezovalcem GSAT in prepoznavnim mestom za proteazo TEV z optimizirano rabo kodona za ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373012 \|\| multigenski konstrukt za metabolno pot razgradnje atrazina v ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373012 BBa_K3373012] \|\| multigenski konstrukt za metabolno pot razgradnje atrazina v ''C. reinhardtii''
	\|-		\|-
	\| BBa_K3373014 \|\| multigenski konstrukt za samomorilsko stikalo v ''C. reinhardtii''		\| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3373014 BBa_K3373014] \|\| multigenski konstrukt za samomorilsko stikalo v ''C. reinhardtii''
	\|}		\|}