https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?action=history&feed=atom&title=Transgenske_koko%C5%A1i 2026-05-22T05:20:55Z Revision history for this page on the wiki MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Transgenske_koko%C5%A1i&diff=8539&oldid=prev 2013-11-22T12:11:14Z

<p>New page: = IZRAŽANJE HUMANE EKSTRACELULARNE SUPEROKSID DISMUTAZE V TRANSGENSKIH KOKOŠIH = [[http://www.bmbreports.org/jbmb/pdf.php?data=MTMxMTIyMThAcGRmX3JhaW50cmFjZV9sZWV5c0AlNUI0Ni04JTVEMTMwOD...</p> <p><b>New page</b></p><div>= IZRAŽANJE HUMANE EKSTRACELULARNE SUPEROKSID DISMUTAZE V TRANSGENSKIH KOKOŠIH =<br /> <br /> [[http://www.bmbreports.org/jbmb/pdf.php?data=MTMxMTIyMThAcGRmX3JhaW50cmFjZV9sZWV5c0AlNUI0Ni04JTVEMTMwODI4MjIzMV80MDQucGRm Byun SJ et al. Human extracellular superoxide dismutaze (EC-SOD) expression in transgenic chicken.]]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Superoksid dismutaza (SOD) je metaloprotein z antioksidativno encimsko funkcijo. Encimi iz družine SOD<br /> so deloma odgovorni za vzdrževanje nizkih vrednosti reaktivnih kisikovih zvrsti - to jim omogoča lastnost<br /> presnavljanja superoksidnega aniona v kisik in vodikov peroksid. Ena izmed 3 izoform encima je ekstracelularna<br /> SOD (EC-SOD). Le-ta je homotetrameren glikoprotein z vsebnostjo Cu in Zn in visoko afiniteto za heparin ter ostale<br /> sulfonirane glikozaminoglikane. Izražanje EC-SOD je visoko v pljučih, ledvicah, maternici in krvnih žilah.<br /> Nahaja se v ekstracelularnem matriksu in je edini antioksidant, ki cepi superoksid v ekstracelularnem <br /> kompartmentu. Pred oksidativnim stresom naj bi ščitila možgane, pljuča in ostala tkiva. Rekombinantno<br /> EC-SOD so doslej izrazili v CHO celicah, insektnih celicah, &#039;&#039;Pichii pastoris&#039;&#039; in &#039;&#039;E. coli&#039;&#039;, avtorji pa so jo<br /> prvič izrazili v ptičih.<br /> <br /> Za dotično raziskavo so se odločili zaradi naraščajoče pomembnosti in zahtev po biofarmacevtskih proteinih,<br /> katerih proizvodnja pa je draga in časovno potratna. Avtorji so mnenja, da so za proizvodnjo farmacevtskih<br /> proteinov potrebne alternativne platforme in da je ena izmed možnosti uporaba transgenske živine kot bioreaktorjev.<br /> Transgenske kokoši imajo pred transgenskimi sesalci številne prednosti - sesalci potrebujejo relativno veliko <br /> površino za vzrejo, poleg tega pa je potrebnih nekaj let, da dosežejo spolno zrelost. V nasprotju s tem kokoši<br /> hitro dosežejo spolno zrelost, za vzrejo potrebujemo malo prostora, proizvedejo veliko jajc, ter ni prisotnih<br /> prionskih bolezni. Poleg tega imajo N-glikozilirani ogljikovi hidrati na koncu N-acetilnevramično kislino, kot je<br /> to pri ljudeh.<br /> <br /> == Povzetek metod in materialov ==<br /> <br /> Najučinkovitejša metoda za ustvarjanje transgenskih ptičev je z uporabo lentivirusnih vektorjev, ki jih vnesemo v<br /> embrije sveže izleglih jajc. Avtorji so uporabili lentivirusni vektor, sestavljen iz: 5&#039; dolge terminalne ponovitve,<br /> CMV promotorja, promotorja kokošjega ovalbumina, za katerim so vstavili gen za humano EC-SOD, promotorja SV40, gena<br /> za rezistenco na blasticidin in 3&#039; dolge terminalne ponovitve. Lentivirusni vektor so psevdotipizirali z glikoproteinom<br /> virusa vezikularnega stomatitisa. V centralni del subgerminalne votline so v sveže izglegla jajca injicirali <br /> približno 5000 virusnih delcev na jajce.<br /> <br /> == Povzetek rezultatov ==<br /> <br /> === 1 Ustvarjanje transgenskih kokoši, ki izražajo hEC-SOD ===<br /> <br /> S 5000 virusnimi delci na jajce so injicirali 158 jajc, izvalilo se je 16 G0 piščancev. Ko so dosegli spolno<br /> zrelost, so z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) analizirali semensko tekočino 7 preživelih petelinov. Eden (A354)<br /> je bil nosilec tujega gena.<br /> Transgenskega petelina so križali s kokošjo divjega tipa, izvalilo se je 1195 piščancev. Med njimi sta bila dva<br /> transgenska (G1; G435, H148). Insercijo hEC-SOD so potrdili s Southern blot analizo.<br /> Oba ptiča sta bila moškega spola. Križali so ju s kokošmi divjega tipa, izvalilo se je 122 piščancev G2. Z analizo<br /> PCR so ugotovili, da je razmerje transgenskih proti ne-transgenskim piščancem 56/122 (G435, 30/60; H148, 26/62) in<br /> da ni signifikantnega odstopanja od razmerja, pričakovanega glede na dedovanje po Mendlovih zakonih. Naključno<br /> so izbrali 6 G2 piščancev in jih skupaj z obema G1 petelinoma analizirali, da bi ugotovili število kopij tujega<br /> gena. Vsi so imeli eno kopijo transgena in isto mesto insercije, iz česar so sklepali, da so vsi potomci istega <br /> prekurzorja zarodne celice. Za ugotavljanje mesta insercije hEC-SOD so analizirali genomsko DNA petelina G435.<br /> <br /> === 2 Tkivno specifično izražanje hEC-SOD v jajcevodih transgenskih kokoši ===<br /> <br /> Da bi se rekombinantni protein izrazil tkivno specifično, v jajcevodih kokoši, so v lentivirusni vektor vstavili<br /> 5&#039; regulatorno sekvenco kokošjega ovalbumina. Analiza RT-PCR je pokazala, da se je mRNA hEC-SOD uspešno izrazila<br /> v jajcevodih transgenskih kokoši.<br /> Transkripti mRNA so bili večinoma omejeni na jajcevode, so pa detektirali tudi ektopično izražanje transgena,<br /> in sicer v trebušni slinavki, črevesju in možganskem tkivu.<br /> <br /> === 3 Rekombinantni protein hEC-SOD iz beljaka je funkcionalen ===<br /> <br /> Zbrali so jajca kokoši divjega tipa kot tudi jajca treh hemizigotnih kokoši G2. Rekombinanten hEC-SOD protein se je<br /> izražal v jajčnih beljakih transgenskih kokoši.<br /> Približna velikost protein je bila 30 kDa, koncentracija pa med 10 in 59 ng/mL.<br /> Da bi ugotovili, če je protein funkcionalen, so naredili test, s katerim so merili antioksidativno aktivnost<br /> proteina - rezultati so kazali na višjo antioksidativno aktivnost kot pri divjem tipu.<br /> <br /> == Zaključki ==<br /> <br /> Avtorji so razvili nov sistem za produkcijo rekombinantne hEC-SOD z uporabo transgenskih kokoši oz. izražanja tega protein<br /> v beljakih transgenskih kokoši. Takšni sistemi so dobra perspektiva za komercialno produkcijo rekombinantnih proteinov.</div>

Andrea Grof