Uporabna vrednost transpozonov za gensko zdravljenje - Revision history

Jan Kogovšek: /* piggyBac */

2022-05-02T12:55:55Z

piggyBac

← Older revision		Revision as of 12:55, 2 May 2022
Line 42:		Line 42:
	==''piggyBac''==		==''piggyBac''==

	''piggyBac'' (''PB'') transpozon je bil prvič odkrit in izoliran iz Zeljne sovke. Prvo odkriti ''PB'' transpozon ima 2.475 baznih parov in kodira 594 aminokislinskih ostankov dolg transpozazni gen. Tako kot SBaza tudi PBaza vsebuje katalitično domeno z DDE/D motivom, ki interegira z (Mg<sup>2+</sup>) ioni med transpozicijo. C-končno zaporedje PBaze vsebuje cinkov vezavni prst, ki ima ohranjene cisteinske ostanke. Ta vektor uporabi sistem 'cut and paste' oz. izreži in prilepi, kjer PBaza prepozna dva TIR (končno obrnjeno zaporedje) ''PB'' transpozona. Za razliko od ''SB'', je prednostno genomsko mesto vstavljanja za ''PB'', TTAA zaporedje. Po vezavi PBaze na transpozon, sledi cepitev 3' konca ~~vektorja~~, kar ima kot posledico prosto OH skupino na 3' koncu. To omogoča povezavo s TTAA zaporedjem na 5' koncu tako, da nastane lasnična zanka. Transpozonski vektor se po tem sprosti iz genoma in se veže na novo zaporedje TTAA na genomu, kjer transpozaza omogoča cepitev vezi in vstavitev vektorja v ~~genom~~. Ugotovili so tudi, da ima ''SB'' bolj naključno vstavljanje v DNA kot ''PB'', ki favorizira z geni bogate regije in začetnimi mesti transkripcije.		''piggyBac'' (''PB'') transpozon je bil prvič odkrit in izoliran iz Zeljne sovke. Prvo odkriti ''PB'' transpozon ima 2.475 baznih parov in kodira 594 aminokislinskih ostankov dolg transpozazni gen. Tako kot SBaza tudi PBaza vsebuje katalitično domeno z DDE/D motivom, ki interegira z (Mg<sup>2+</sup>) ioni med transpozicijo. C-končno zaporedje PBaze vsebuje cinkov vezavni prst, ki ima ohranjene cisteinske ostanke. Ta vektor uporabi sistem 'cut and paste' oz. izreži in prilepi, kjer PBaza prepozna dva TIR (končno obrnjeno zaporedje) ''PB'' transpozona. Za razliko od ''SB'', je prednostno genomsko mesto vstavljanja za ''PB'', TTAA zaporedje. Po vezavi PBaze na transpozon, sledi cepitev 3' konca transpozonske DNA, kar ima kot posledico prosto OH skupino na 3' koncu. To omogoča povezavo s TTAA zaporedjem na 5' koncu tako, da nastane lasnična zanka. Transpozonski vektor se po tem sprosti iz genoma in se veže na novo zaporedje TTAA na genomu, kjer transpozaza omogoča cepitev vezi in vstavitev vektorja v DNA. Ugotovili so tudi, da ima ''SB'' bolj naključno vstavljanje v DNA kot ''PB'', ki favorizira z geni bogate regije in začetnimi mesti transkripcije.

	Če želimo popraviti oz. vstaviti gene v DNA potrebujemo mehanizem homologne rekombinacije. Vendar je znano, da ima homologna rekombinacija slabo učinkovitost pri odraslih oz. razvitih celicah, saj te ne vsebujejo mehanizma homologne rekombinacije. Zato je pri odraslih celicah vodilno nehomologno končno združevanje nukleotidov, kar se kaže v pogostih škodljivih mutacijah, ki lahko povzročijo izgubo gena. Pri ''piggyBac'' gre za mehanizem, kjer transpozaza ne potrebuje drugih celičnih kofaktorjev za vstavljanje zaporedja v DNA, hkrati pa ''piggyBac'' lahko nadzorujemo z uravnavanjem količine injiciranega transpozona. Odkrili so, da je ''piggyBac'' trenutno edini transpozonski element, ki po izrezu iz DNA ne pušča odtisa, ki bi lahko dodatno poškodoval zaporedje in povzročil nadaljnje mutacije. Kljub vsem raziskavam, še vedno ostajajo vprašanja, kot na primer: ali je ''piggyBac'' dovolj varnostno preverjen za uporabo v genski terapiji in ali bo tarčnost transpozona povečala selektivnost in učinkovitost genske terapije.		Če želimo popraviti oz. vstaviti gene v DNA potrebujemo mehanizem homologne rekombinacije. Vendar je znano, da ima homologna rekombinacija slabo učinkovitost pri odraslih oz. razvitih celicah, saj te ne vsebujejo mehanizma homologne rekombinacije. Zato je pri odraslih celicah vodilno nehomologno končno združevanje nukleotidov, kar se kaže v pogostih škodljivih mutacijah, ki lahko povzročijo izgubo gena. Pri ''piggyBac'' gre za mehanizem, kjer transpozaza ne potrebuje drugih celičnih kofaktorjev za vstavljanje zaporedja v DNA, hkrati pa ''piggyBac'' lahko nadzorujemo z uravnavanjem količine injiciranega transpozona. Odkrili so, da je ''piggyBac'' trenutno edini transpozonski element, ki po izrezu iz DNA ne pušča odtisa, ki bi lahko dodatno poškodoval zaporedje in povzročil nadaljnje mutacije. Kljub vsem raziskavam, še vedno ostajajo vprašanja, kot na primer: ali je ''piggyBac'' dovolj varnostno preverjen za uporabo v genski terapiji in ali bo tarčnost transpozona povečala selektivnost in učinkovitost genske terapije.

Jan Kogovšek: /* Hemofilija B */

2022-05-02T12:54:01Z

Hemofilija B

← Older revision		Revision as of 12:54, 2 May 2022
Line 54:		Line 54:
	===Hemofilija B===		===Hemofilija B===

	Pri tej bolezni gre za zmanjšano količino faktorja IX (FIX), ki sodeluje pri strjevanju krvi, posledično imajo bolniki povečano možnost krvavitev. Na miših, ki imajo okvarjen FIX, so uporabili ''PB'' transpozon, ki je imel v svoj zapis poleg transpozaze vstavljen tudi promotor za FIX, kar je povzročilo povečano izražanje tega faktorja ter na ta način miši ozdravili hemofilije B. Prišli so tudi do sklepa, da bi z dodatnim izboljšanjem ''PB'' lahko omogočili še večjo učinkovitost transpozonov, ki imajo vstavljene daljše gene, kar bi omogočilo tudi zdravljenje hemofilije A, kjer pa gre za zmanjšano izražanje faktorja VIII, ki je tudi pomemben pri strjevanju krvi. V študiji so uporabili več različno spremenjenih transpozonov, s čimer so želeli povečati učinkovitost izražanja gena ter zmanjšati terapevtski odmerek za miši. Ugotovili so, da aktivnost in stabilnost antigena FIX traja več kot 12 mesecev, kar kaže na učinkovito metodo zdravljenja, brez večjih posledic na samo telo. Uporabo transpozonov so tudi ~~analizirali~~ v miših nagnjenih k razvoju hepatičnega karcinoma, vendar niso opazili znakov, ki bi nakazovali na onkogenost ''PB'' transpozicije.		Pri tej bolezni gre za zmanjšano količino faktorja IX (FIX), ki sodeluje pri strjevanju krvi, posledično imajo bolniki povečano možnost krvavitev. Na miših, ki imajo okvarjen FIX, so uporabili ''PB'' transpozon, ki je imel v svoj zapis poleg transpozaze vstavljen tudi promotor za FIX, kar je povzročilo povečano izražanje tega faktorja ter na ta način miši ozdravili hemofilije B. Prišli so tudi do sklepa, da bi z dodatnim izboljšanjem ''PB'' lahko omogočili še večjo učinkovitost transpozonov, ki imajo vstavljene daljše gene, kar bi omogočilo tudi zdravljenje hemofilije A, kjer pa gre za zmanjšano izražanje faktorja VIII, ki je tudi pomemben pri strjevanju krvi. V študiji so uporabili več različno spremenjenih transpozonov, s čimer so želeli povečati učinkovitost izražanja gena ter zmanjšati terapevtski odmerek za miši. Ugotovili so, da aktivnost in stabilnost antigena FIX traja več kot 12 mesecev, kar kaže na učinkovito metodo zdravljenja, brez večjih posledic na samo telo. Uporabo transpozonov so tudi testirali v miših nagnjenih k razvoju hepatičnega karcinoma, vendar niso opazili znakov, ki bi nakazovali na onkogenost ''PB'' transpozicije.

	==Literatura:==		==Literatura:==

Lana Kores: /* Sleeping Beauty (SB) */

2022-05-02T11:58:20Z

Sleeping Beauty (SB)

← Older revision		Revision as of 11:58, 2 May 2022
Line 32:		Line 32:
	''SB'' transpozon je bil prvotno velik 1,6 kb in je bil sestavljen iz dveh invertnih ponovitev/direktnih ponovitev (ang. “inverted repeats/direct repeats”, IR/DRs), ki obdajata gen, ki kodira 360-aminokislin dolgo ''SB'' transpozazo (SBazo). V vsakem IR/DR sta prisotni dve vezavni regiji za transpozazo oz. direktni ponovitvi, obe sta pomembni za prepoznavanje transpozaze. Za razliko od desnega IR/DR, levi IR/DR vsebuje 11 bp dolgo sekvenco DNA podobno 3'-polovici DR, specifično HDR motiv, ki zelo poveča transpozicijo.		''SB'' transpozon je bil prvotno velik 1,6 kb in je bil sestavljen iz dveh invertnih ponovitev/direktnih ponovitev (ang. “inverted repeats/direct repeats”, IR/DRs), ki obdajata gen, ki kodira 360-aminokislin dolgo ''SB'' transpozazo (SBazo). V vsakem IR/DR sta prisotni dve vezavni regiji za transpozazo oz. direktni ponovitvi, obe sta pomembni za prepoznavanje transpozaze. Za razliko od desnega IR/DR, levi IR/DR vsebuje 11 bp dolgo sekvenco DNA podobno 3'-polovici DR, specifično HDR motiv, ki zelo poveča transpozicijo.

	Za gensko terapijo so prvoten ''SB'' sistem pretvorili v dvokomponenten sistem z ločitvijo dveh IR/DR-jev (ki obdajata željen gen) od SBaznega gena na dva nova plazmida. Ta dva plazmida sta sočasno vnesena v tarčne celice, kjer transpozicija poteče preko mehanizma 'kopiraj-in-prilepi' (tako kot pri nativnem transpozonu). Izražanje SBaze s plazmidi predstavlja tveganje za pretirano integracijo teh plazmidov, ki lahko privede do insercijske onkogeneze. Kot varnejšo alternativo je možno SBazo dostaviti tudi kot mRNA. SBazno mRNA v celico po navadi vstavijo z elektroporacijo. Nedavno so razvili izboljšan pristop prenosa mRNA z retrovirusnimi delci (RMT), ki omogoča prehodno in količinsko nadzorovano izražanje SBaze. Kratkotrajna prisotnost SBaze tako omogoča kratko okno za transpozicijo in hkrati zmanjšuje možnost za pojav insercijske onkogeneze.		Za gensko terapijo so prvoten ''SB'' sistem pretvorili v dvokomponenten sistem z ločitvijo dveh IR/DR-jev (ki obdajata željen gen) od SBaznega gena na dva nova plazmida. Ta dva plazmida sta sočasno vnesena v tarčne celice, kjer transpozicija poteče preko mehanizma 'kopiraj-in-prilepi' (tako kot pri nativnem transpozonu). Izražanje SBaze s plazmidi predstavlja tveganje za pretirano integracijo teh plazmidov, ki lahko privede do insercijske onkogeneze. Kot varnejšo alternativo je možno SBazo dostaviti tudi kot mRNA. SBazno mRNA v celico po navadi vstavijo z elektroporacijo. Nedavno so razvili izboljšan pristop prenosa mRNA z retrovirusnimi delci (RMT, ang. “retrovirus particle-mediated mRNA transfer”), ki omogoča prehodno in količinsko nadzorovano izražanje SBaze. Kratkotrajna prisotnost SBaze tako omogoča kratko okno za transpozicijo in hkrati zmanjšuje možnost za pojav insercijske onkogeneze.

	Učinkovitost ''SB'' transpozicije so poskušali še izboljšati, med drugim tudi z generacijo hiperaktivnih transpozaznih mutantov. To so naredili tako, da so v originalno SBazo (SB10) vgradili skupne aminokisline transpozaz iz različnih organizmov. Eden izmed mutantov je SB100X, ki se od drugih SBaz razlikuje po tem, da je bil generiran ''in vitro'' z molekularno evolucijo in selekcijo. Pri uporabi tehnike 'marker rescue assay' ima kar 100-krat večjo učinkovitost v mobilizaciji transpozona kot SB10 in ga imajo za najbolj aktivno SBazo do zdaj.		Učinkovitost ''SB'' transpozicije so poskušali še izboljšati, med drugim tudi z generacijo hiperaktivnih transpozaznih mutantov. To so naredili tako, da so v originalno SBazo (SB10) vgradili skupne aminokisline transpozaz iz različnih organizmov. Eden izmed mutantov je SB100X, ki se od drugih SBaz razlikuje po tem, da je bil generiran ''in vitro'' z molekularno evolucijo in selekcijo. Pri uporabi tehnike 'marker rescue assay' ima kar 100-krat večjo učinkovitost v mobilizaciji transpozona kot SB10 in ga imajo za najbolj aktivno SBazo do zdaj.

Jan Kogovšek: /* piggyBac */

2022-05-02T06:38:32Z

piggyBac

← Older revision		Revision as of 06:38, 2 May 2022
Line 42:		Line 42:
	==''piggyBac''==		==''piggyBac''==

	''piggyBac'' (''PB'') transpozon je bil prvič odkrit in izoliran iz Zeljne sovke. Prvo odkriti ''PB'' transpozon ima 2.475 baznih parov in kodira 594 aminokislinskih ostankov dolg transpozazni gen. Tako kot SBaza tudi PBaza vsebuje katalitično domeno z DDE/D motivom, ki interegira z (Mg<sup>2+</sup>) ioni med transpozicijo. C-končno zaporedje PBaze vsebuje cinkov vezavni prst, ki ima ohranjene cisteinske ostanke. Ta vektor uporabi sistem 'cut and paste' oz. izreži in prilepi, kjer PBaza prepozna dva TIR (končno obrnjeno zaporedje) ''PB'' transpozona. Za razliko od ''SB'', je prednostno genomsko mesto vstavljanja za ''PB'', TTAA zaporedje. Po vezavi PBaze na transpozon, sledi cepitev 3' konca ~~DNA~~, kar ima kot posledico prosto OH skupino na 3' koncu. To omogoča povezavo s TTAA zaporedjem na 5' koncu tako, da nastane lasnična zanka. Transpozonski vektor se po tem sprosti iz genoma in se veže na novo zaporedje TTAA na genomu, kjer transpozaza omogoča cepitev vezi in vstavitev vektorja v genom. Ugotovili so tudi, da ima ''SB'' bolj naključno vstavljanje v DNA kot ''PB'', ki favorizira z geni bogate regije in začetnimi mesti transkripcije.		''piggyBac'' (''PB'') transpozon je bil prvič odkrit in izoliran iz Zeljne sovke. Prvo odkriti ''PB'' transpozon ima 2.475 baznih parov in kodira 594 aminokislinskih ostankov dolg transpozazni gen. Tako kot SBaza tudi PBaza vsebuje katalitično domeno z DDE/D motivom, ki interegira z (Mg<sup>2+</sup>) ioni med transpozicijo. C-končno zaporedje PBaze vsebuje cinkov vezavni prst, ki ima ohranjene cisteinske ostanke. Ta vektor uporabi sistem 'cut and paste' oz. izreži in prilepi, kjer PBaza prepozna dva TIR (končno obrnjeno zaporedje) ''PB'' transpozona. Za razliko od ''SB'', je prednostno genomsko mesto vstavljanja za ''PB'', TTAA zaporedje. Po vezavi PBaze na transpozon, sledi cepitev 3' konca vektorja, kar ima kot posledico prosto OH skupino na 3' koncu. To omogoča povezavo s TTAA zaporedjem na 5' koncu tako, da nastane lasnična zanka. Transpozonski vektor se po tem sprosti iz genoma in se veže na novo zaporedje TTAA na genomu, kjer transpozaza omogoča cepitev vezi in vstavitev vektorja v genom. Ugotovili so tudi, da ima ''SB'' bolj naključno vstavljanje v DNA kot ''PB'', ki favorizira z geni bogate regije in začetnimi mesti transkripcije.

	Če želimo popraviti oz. vstaviti gene v DNA potrebujemo mehanizem homologne rekombinacije. Vendar je znano, da ima homologna rekombinacija slabo učinkovitost pri odraslih oz. razvitih celicah, saj te ne vsebujejo mehanizma homologne rekombinacije. Zato je pri odraslih celicah vodilno nehomologno končno združevanje nukleotidov, kar se kaže v pogostih škodljivih mutacijah, ki lahko povzročijo izgubo gena. Pri ''piggyBac'' gre za mehanizem, kjer transpozaza ne potrebuje drugih celičnih kofaktorjev za vstavljanje zaporedja v DNA, hkrati pa ''piggyBac'' lahko nadzorujemo z uravnavanjem količine injiciranega transpozona. Odkrili so, da je ''piggyBac'' trenutno edini transpozonski element, ki po izrezu iz DNA ne pušča odtisa, ki bi lahko dodatno poškodoval zaporedje in povzročil nadaljnje mutacije. Kljub vsem raziskavam, še vedno ostajajo vprašanja, kot na primer: ali je ''piggyBac'' dovolj varnostno preverjen za uporabo v genski terapiji in ali bo tarčnost transpozona povečala selektivnost in učinkovitost genske terapije.		Če želimo popraviti oz. vstaviti gene v DNA potrebujemo mehanizem homologne rekombinacije. Vendar je znano, da ima homologna rekombinacija slabo učinkovitost pri odraslih oz. razvitih celicah, saj te ne vsebujejo mehanizma homologne rekombinacije. Zato je pri odraslih celicah vodilno nehomologno končno združevanje nukleotidov, kar se kaže v pogostih škodljivih mutacijah, ki lahko povzročijo izgubo gena. Pri ''piggyBac'' gre za mehanizem, kjer transpozaza ne potrebuje drugih celičnih kofaktorjev za vstavljanje zaporedja v DNA, hkrati pa ''piggyBac'' lahko nadzorujemo z uravnavanjem količine injiciranega transpozona. Odkrili so, da je ''piggyBac'' trenutno edini transpozonski element, ki po izrezu iz DNA ne pušča odtisa, ki bi lahko dodatno poškodoval zaporedje in povzročil nadaljnje mutacije. Kljub vsem raziskavam, še vedno ostajajo vprašanja, kot na primer: ali je ''piggyBac'' dovolj varnostno preverjen za uporabo v genski terapiji in ali bo tarčnost transpozona povečala selektivnost in učinkovitost genske terapije.

Lana Kores: /* Sleeping Beauty (SB) */

2022-05-01T20:07:07Z

Sleeping Beauty (SB)

← Older revision		Revision as of 20:07, 1 May 2022
Line 28:		Line 28:
	==''Sleeping Beauty'' (''SB'')==		==''Sleeping Beauty'' (''SB'')==

	Transpozon Sleeping Beauty (''SB'') spada v naddružino transpozonov Tc1/mariner, ki so razširjeni v mnogo evkariontskih organizmih. Ti transpozoni so bili na začetku utišani, predvsem zaradi kopičenja inaktivacijskih mutacij v transpozaznih genih. Transpozicijsko aktivnost so pokazali šele z rekonstrukcijo transpozaznega gena z 'reverzno evolucijo' iz drugih ribjih transpozonov.		Transpozon Sleeping Beauty (''SB'') spada v naddružino transpozonov ''Tc1/mariner'', ki so razširjeni v mnogo evkariontskih organizmih. Ti transpozoni so bili na začetku utišani, predvsem zaradi kopičenja inaktivacijskih mutacij v transpozaznih genih. Transpozicijsko aktivnost so pokazali šele z rekonstrukcijo transpozaznega gena z 'reverzno evolucijo' iz drugih ribjih transpozonov.

	''SB'' transpozon je bil prvotno velik 1,6 kb in je bil sestavljen iz dveh invertnih ponovitev/direktnih ponovitev (ang. “inverted repeats/direct repeats”, IR/DRs), ki obdajata gen, ki kodira 360-aminokislin dolgo ''SB'' transpozazo (SBazo). V vsakem IR/DR sta prisotni dve vezavni regiji za transpozazo oz. direktni ponovitvi, obe sta pomembni za prepoznavanje transpozaze. Za razliko od desnega IR/DR, levi IR/DR vsebuje 11 bp dolgo sekvenco DNA podobno 3'-polovici DR, specifično HDR motiv, ki zelo poveča transpozicijo.		''SB'' transpozon je bil prvotno velik 1,6 kb in je bil sestavljen iz dveh invertnih ponovitev/direktnih ponovitev (ang. “inverted repeats/direct repeats”, IR/DRs), ki obdajata gen, ki kodira 360-aminokislin dolgo ''SB'' transpozazo (SBazo). V vsakem IR/DR sta prisotni dve vezavni regiji za transpozazo oz. direktni ponovitvi, obe sta pomembni za prepoznavanje transpozaze. Za razliko od desnega IR/DR, levi IR/DR vsebuje 11 bp dolgo sekvenco DNA podobno 3'-polovici DR, specifično HDR motiv, ki zelo poveča transpozicijo.

	Za gensko terapijo so prvoten ''SB'' sistem pretvorili v dvokomponenten sistem z ločitvijo dveh IR/DR-jev (ki obdajata željen gen) od SBaznega gena na dva nova plazmida. Ta dva plazmida sta sočasno vnesena v tarčne celice, kjer transpozicija poteče preko '~~cut~~-~~and~~-~~paste~~' ~~mehanizma~~ (tako kot pri nativnem transpozonu). Izražanje SBaze s plazmidi predstavlja tveganje za pretirano integracijo teh plazmidov, ki lahko privede do insercijske onkogeneze. Kot varnejšo alternativo je možno SBazo dostaviti tudi kot mRNA. SBazno mRNA v celico po navadi vstavijo z elektroporacijo. Nedavno so razvili izboljšan pristop prenosa mRNA z retrovirusnimi delci (RMT), ki omogoča prehodno in količinsko nadzorovano izražanje SBaze. Kratkotrajna prisotnost SBaze tako omogoča kratko okno za transpozicijo in hkrati zmanjšuje možnost za pojav insercijske onkogeneze.		Za gensko terapijo so prvoten ''SB'' sistem pretvorili v dvokomponenten sistem z ločitvijo dveh IR/DR-jev (ki obdajata željen gen) od SBaznega gena na dva nova plazmida. Ta dva plazmida sta sočasno vnesena v tarčne celice, kjer transpozicija poteče preko mehanizma 'kopiraj-in-prilepi' (tako kot pri nativnem transpozonu). Izražanje SBaze s plazmidi predstavlja tveganje za pretirano integracijo teh plazmidov, ki lahko privede do insercijske onkogeneze. Kot varnejšo alternativo je možno SBazo dostaviti tudi kot mRNA. SBazno mRNA v celico po navadi vstavijo z elektroporacijo. Nedavno so razvili izboljšan pristop prenosa mRNA z retrovirusnimi delci (RMT), ki omogoča prehodno in količinsko nadzorovano izražanje SBaze. Kratkotrajna prisotnost SBaze tako omogoča kratko okno za transpozicijo in hkrati zmanjšuje možnost za pojav insercijske onkogeneze.

	Učinkovitost ''SB'' transpozicije so poskušali še izboljšati, med drugim tudi z generacijo hiperaktivnih transpozaznih mutantov. To so naredili tako, da so v originalno SBazo (SB10) vgradili skupne aminokisline transpozaz iz različnih organizmov. Eden izmed mutantov je SB100X, ki se od drugih SBaz razlikuje po tem, da je bil generiran in vitro z molekularno evolucijo in selekcijo. ~~Z uporabo~~ 'marker rescue assay' ima kar 100-krat večjo učinkovitost v mobilizaciji transpozona kot SB10 in ga imajo za najbolj aktivno SBazo do zdaj.		Učinkovitost ''SB'' transpozicije so poskušali še izboljšati, med drugim tudi z generacijo hiperaktivnih transpozaznih mutantov. To so naredili tako, da so v originalno SBazo (SB10) vgradili skupne aminokisline transpozaz iz različnih organizmov. Eden izmed mutantov je SB100X, ki se od drugih SBaz razlikuje po tem, da je bil generiran ''in vitro'' z molekularno evolucijo in selekcijo. Pri uporabi tehnike 'marker rescue assay' ima kar 100-krat večjo učinkovitost v mobilizaciji transpozona kot SB10 in ga imajo za najbolj aktivno SBazo do zdaj.

	===HSC ~~(Hematopoietic Stem Cells~~)===		===Hematopoetske matične celice (HSC)===

	Zaradi zmožnosti samoobnavljanja in diferenciacije v različne limfo-~~hematopoetične~~ celice, so HSC ~~(Hematopoietic~~ stem ~~cells~~) obetavne za gensko terapijo. Sprva so za stabilen vnos genov v HSC uporabili ''SB'' transpozon zgodnje generacije (SB10); učinkovitost je bila relativno majhna in niso našli nobenih dokazov, ki bi podpirali učinkovito hematopoetično rekonstrukcijo in 'multi-lineage marking' ''in vivo''. To jim je kasneje uspelo v transpozonsko modificiranih CD34<sup>+</sup> HSC z uporabo SB100X sistema. Pokazali so, da se sposobnost za stabilno dostavo genov v CD34<sup>+</sup> HSC lahko raztegne tudi na ''PB'' sistem, vendar je bil SB100X bolj učinkovit. Da pa bi lahko z gotovostjo rekli, kateri sistem je boljši, bi bila potrebna primerjalna študija še z zadnjo generacijo hyPBaz (ang. “hyper-active PBaze”).		Zaradi zmožnosti samoobnavljanja in diferenciacije v različne limfo-hematopoetske celice, so hematopoetske matične celice (HSC, ang. “hematopoietic stem cells”) obetavne za gensko terapijo. Sprva so za stabilen vnos genov v HSC uporabili ''SB'' transpozon zgodnje generacije (SB10); učinkovitost je bila relativno majhna in niso našli nobenih dokazov, ki bi podpirali učinkovito hematopoetično rekonstrukcijo in 'multi-lineage marking' ''in vivo''. To jim je kasneje uspelo v transpozonsko modificiranih CD34<sup>+</sup> HSC z uporabo SB100X sistema. Pokazali so, da se sposobnost za stabilno dostavo genov v CD34<sup>+</sup> HSC lahko raztegne tudi na ''PB'' sistem, vendar je bil SB100X bolj učinkovit. Da pa bi lahko z gotovostjo rekli, kateri sistem je boljši, bi bila potrebna primerjalna študija še z zadnjo generacijo hyPBaz (ang. “hyper-active PBaze”).

	==''piggyBac''==		==''piggyBac''==

Jan Kogovšek: /* Sleeping Beauty (SB) */

2022-04-26T13:20:21Z

Sleeping Beauty (SB)

← Older revision		Revision as of 13:20, 26 April 2022
Line 26:		Line 26:
	Ta način vnosa se izkorišča za zdravljenje hemofilije A in B, srpasto celične anemije, diabetesa tipa 1 in drugih. Kljub temu pa ta metoda predstavlja tudi nevarnost razvoja hepatotoksičnosti.		Ta način vnosa se izkorišča za zdravljenje hemofilije A in B, srpasto celične anemije, diabetesa tipa 1 in drugih. Kljub temu pa ta metoda predstavlja tudi nevarnost razvoja hepatotoksičnosti.

	==Sleeping Beauty (''SB'')==		==''Sleeping Beauty'' (''SB'')==

	Transpozon Sleeping Beauty (''SB'') spada v naddružino transpozonov Tc1/mariner, ki so razširjeni v mnogo evkariontskih organizmih. Ti transpozoni so bili na začetku utišani, predvsem zaradi kopičenja inaktivacijskih mutacij v transpozaznih genih. Transpozicijsko aktivnost so pokazali šele z rekonstrukcijo transpozaznega gena z 'reverzno evolucijo' iz drugih ribjih transpozonov.		Transpozon Sleeping Beauty (''SB'') spada v naddružino transpozonov Tc1/mariner, ki so razširjeni v mnogo evkariontskih organizmih. Ti transpozoni so bili na začetku utišani, predvsem zaradi kopičenja inaktivacijskih mutacij v transpozaznih genih. Transpozicijsko aktivnost so pokazali šele z rekonstrukcijo transpozaznega gena z 'reverzno evolucijo' iz drugih ribjih transpozonov.

Jan Kogovšek: /* Literatura: */

2022-04-26T12:33:40Z

Literatura:

← Older revision		Revision as of 12:33, 26 April 2022
Line 58:		Line 58:
	==Literatura:==		==Literatura:==

	1. J. Tipanee, T. VandenDriessche, and M. K. Chuah, “Transposons: Moving Forward from Preclinical Studies to Clinical Trials,” ''Human Gene Therapy'', vol. 28, no. 11, pp. 1087–1104, Nov. 2017, doi: 10.1089/HUM.2017.128~~/ASSET/IMAGES/LARGE/FIGURE2.JPEG~~.		1. J. Tipanee, T. VandenDriessche, and M. K. Chuah, “Transposons: Moving Forward from Preclinical Studies to Clinical Trials,” ''Human Gene Therapy'', vol. 28, no. 11, pp. 1087–1104, Nov. 2017, doi: 10.1089/HUM.2017.128.

	2. M. di Matteo et al., “Hyperactive PiggyBac transposons for sustained and robust liver-targeted gene therapy,” ''Molecular Therapy'', vol. 22, no. 9, pp. 1614–1624, 2014, doi: 10.1038/MT.2014.131.		2. M. di Matteo et al., “Hyperactive PiggyBac transposons for sustained and robust liver-targeted gene therapy,” ''Molecular Therapy'', vol. 22, no. 9, pp. 1614–1624, 2014, doi: 10.1038/MT.2014.131.

Jan Kogovšek: /* Hemofilija B */

2022-04-26T12:32:00Z

Hemofilija B

← Older revision		Revision as of 12:32, 26 April 2022
Line 54:		Line 54:
	===Hemofilija B===		===Hemofilija B===

	Pri tej bolezni gre za zmanjšano količino faktorja IX (FIX), ki sodeluje pri strjevanju krvi, posledično imajo bolniki povečano možnost krvavitev. Na miših, ki imajo okvarjen FIX, so uporabili ''PB'' transpozon, ki je imel v svoj zapis poleg transpozaze vstavljen tudi promotor za FIX, kar je povzročilo povečano izražanje tega faktorja ter na ta način miši ozdravili hemofilije B. Prišli so tudi do sklepa, da bi z dodatnim izboljšanjem ''PB'' lahko omogočili še večjo učinkovitost transpozonov, ki imajo vstavljene daljše gene, kar bi omogočilo tudi zdravljenje hemofilije A, kjer pa gre za zmanjšano izražanje faktorja VIII, ki je tudi pomemben pri strjevanju krvi. V študiji so uporabili več različno spremenjenih transpozonov, s čimer so želeli povečati učinkovitost izražanja gena ter zmanjšati terapevtski odmerek za miši. Ugotovili so, da aktivnost in stabilnost antigena FIX traja več kot 12 mesecev, kar kaže na učinkovito metodo zdravljenja, brez večjih posledic na samo telo. Uporabo transpozonov so tudi analizirali v miših nagnjenih k razvoju hepatičnega karcinoma, vendar niso opazili znakov, ki bi nakazovali na onkogenost ''PB'' transpozicije.		Pri tej bolezni gre za zmanjšano količino faktorja IX (FIX), ki sodeluje pri strjevanju krvi, posledično imajo bolniki povečano možnost krvavitev. Na miših, ki imajo okvarjen FIX, so uporabili ''PB'' transpozon, ki je imel v svoj zapis poleg transpozaze vstavljen tudi promotor za FIX, kar je povzročilo povečano izražanje tega faktorja ter na ta način miši ozdravili hemofilije B. Prišli so tudi do sklepa, da bi z dodatnim izboljšanjem ''PB'' lahko omogočili še večjo učinkovitost transpozonov, ki imajo vstavljene daljše gene, kar bi omogočilo tudi zdravljenje hemofilije A, kjer pa gre za zmanjšano izražanje faktorja VIII, ki je tudi pomemben pri strjevanju krvi. V študiji so uporabili več različno spremenjenih transpozonov, s čimer so želeli povečati učinkovitost izražanja gena ter zmanjšati terapevtski odmerek za miši. Ugotovili so, da aktivnost in stabilnost antigena FIX traja več kot 12 mesecev, kar kaže na učinkovito metodo zdravljenja, brez večjih posledic na samo telo. Uporabo transpozonov so tudi analizirali v miših nagnjenih k razvoju hepatičnega karcinoma, vendar niso opazili znakov, ki bi nakazovali na onkogenost ''PB'' transpozicije.

	==Literatura:==		==Literatura:==

Jan Kogovšek: /* Sleeping Beauty (SB) */

2022-04-26T12:31:11Z

Sleeping Beauty (SB)

← Older revision		Revision as of 12:31, 26 April 2022
Line 30:		Line 30:
	Transpozon Sleeping Beauty (''SB'') spada v naddružino transpozonov Tc1/mariner, ki so razširjeni v mnogo evkariontskih organizmih. Ti transpozoni so bili na začetku utišani, predvsem zaradi kopičenja inaktivacijskih mutacij v transpozaznih genih. Transpozicijsko aktivnost so pokazali šele z rekonstrukcijo transpozaznega gena z 'reverzno evolucijo' iz drugih ribjih transpozonov.		Transpozon Sleeping Beauty (''SB'') spada v naddružino transpozonov Tc1/mariner, ki so razširjeni v mnogo evkariontskih organizmih. Ti transpozoni so bili na začetku utišani, predvsem zaradi kopičenja inaktivacijskih mutacij v transpozaznih genih. Transpozicijsko aktivnost so pokazali šele z rekonstrukcijo transpozaznega gena z 'reverzno evolucijo' iz drugih ribjih transpozonov.

	''SB'' transpozon je bil prvotno velik 1,6 kb in je bil sestavljen iz dveh invertnih ponovitev/direktnih ponovitev (ang. “inverted repeats/direct repeats”, IR/DRs), ki obdajata gen, ki kodira 360-aminokislin dolgo SB transpozazo (SBazo). V vsakem IR/DR sta prisotni dve vezavni regiji za transpozazo oz. direktni ponovitvi, obe sta pomembni za prepoznavanje transpozaze. Za razliko od desnega IR/DR, levi IR/DR vsebuje 11 bp dolgo sekvenco DNA podobno 3'-polovici DR, specifično HDR motiv, ki zelo poveča transpozicijo.		''SB'' transpozon je bil prvotno velik 1,6 kb in je bil sestavljen iz dveh invertnih ponovitev/direktnih ponovitev (ang. “inverted repeats/direct repeats”, IR/DRs), ki obdajata gen, ki kodira 360-aminokislin dolgo ''SB'' transpozazo (SBazo). V vsakem IR/DR sta prisotni dve vezavni regiji za transpozazo oz. direktni ponovitvi, obe sta pomembni za prepoznavanje transpozaze. Za razliko od desnega IR/DR, levi IR/DR vsebuje 11 bp dolgo sekvenco DNA podobno 3'-polovici DR, specifično HDR motiv, ki zelo poveča transpozicijo.

	Za gensko terapijo so prvoten ''SB'' sistem pretvorili v dvokomponenten sistem z ločitvijo dveh IR/DR-jev (ki obdajata željen gen) od SBaznega gena na dva nova plazmida. Ta dva plazmida sta sočasno vnesena v tarčne celice, kjer transpozicija poteče preko 'cut-and-paste' mehanizma (tako kot pri nativnem transpozonu). Izražanje SBaze s plazmidi predstavlja tveganje za pretirano integracijo teh plazmidov, ki lahko privede do insercijske onkogeneze. Kot varnejšo alternativo je možno SBazo dostaviti tudi kot mRNA. SBazno mRNA v celico po navadi vstavijo z elektroporacijo. Nedavno so razvili izboljšan pristop prenosa mRNA z retrovirusnimi delci (RMT), ki omogoča prehodno in količinsko nadzorovano izražanje SBaze. Kratkotrajna prisotnost SBaze tako omogoča kratko okno za transpozicijo in hkrati zmanjšuje možnost za pojav insercijske onkogeneze.		Za gensko terapijo so prvoten ''SB'' sistem pretvorili v dvokomponenten sistem z ločitvijo dveh IR/DR-jev (ki obdajata željen gen) od SBaznega gena na dva nova plazmida. Ta dva plazmida sta sočasno vnesena v tarčne celice, kjer transpozicija poteče preko 'cut-and-paste' mehanizma (tako kot pri nativnem transpozonu). Izražanje SBaze s plazmidi predstavlja tveganje za pretirano integracijo teh plazmidov, ki lahko privede do insercijske onkogeneze. Kot varnejšo alternativo je možno SBazo dostaviti tudi kot mRNA. SBazno mRNA v celico po navadi vstavijo z elektroporacijo. Nedavno so razvili izboljšan pristop prenosa mRNA z retrovirusnimi delci (RMT), ki omogoča prehodno in količinsko nadzorovano izražanje SBaze. Kratkotrajna prisotnost SBaze tako omogoča kratko okno za transpozicijo in hkrati zmanjšuje možnost za pojav insercijske onkogeneze.

	Učinkovitost SB transpozicije so poskušali še izboljšati, med drugim tudi z generacijo hiperaktivnih transpozaznih mutantov. To so naredili tako, da so v originalno SBazo (SB10) vgradili skupne aminokisline transpozaz iz različnih organizmov. Eden izmed mutantov je SB100X, ki se od drugih SBaz razlikuje po tem, da je bil generiran in vitro z molekularno evolucijo in selekcijo. Z uporabo 'marker rescue assay' ima kar 100-krat večjo učinkovitost v mobilizaciji transpozona kot SB10 in ga imajo za najbolj aktivno SBazo do zdaj.		Učinkovitost ''SB'' transpozicije so poskušali še izboljšati, med drugim tudi z generacijo hiperaktivnih transpozaznih mutantov. To so naredili tako, da so v originalno SBazo (SB10) vgradili skupne aminokisline transpozaz iz različnih organizmov. Eden izmed mutantov je SB100X, ki se od drugih SBaz razlikuje po tem, da je bil generiran in vitro z molekularno evolucijo in selekcijo. Z uporabo 'marker rescue assay' ima kar 100-krat večjo učinkovitost v mobilizaciji transpozona kot SB10 in ga imajo za najbolj aktivno SBazo do zdaj.

	===HSC (Hematopoietic Stem Cells)===		===HSC (Hematopoietic Stem Cells)===

	Zaradi zmožnosti samoobnavljanja in diferenciacije v različne limfo-hematopoetične celice, so HSC (Hematopoietic stem cells) obetavne za gensko terapijo. Sprva so za stabilen vnos genov v HSC uporabili ''SB'' transpozon zgodnje generacije (SB10); učinkovitost je bila relativno majhna in niso našli nobenih dokazov, ki bi podpirali učinkovito hematopoetično rekonstrukcijo in 'multi-lineage marking' ''in vivo''. To jim je kasneje uspelo v transpozonsko modificiranih CD34+ HSC z uporabo SB100X sistema. Pokazali so, da se sposobnost za stabilno dostavo genov v CD34<sup>+</sup> HSC lahko raztegne tudi na ''PB'' sistem, vendar je bil SB100X bolj učinkovit. Da pa bi lahko z gotovostjo rekli, kateri sistem je boljši, bi bila potrebna primerjalna študija še z zadnjo generacijo hyPBaz (ang. “hyper-active PBaze”).		Zaradi zmožnosti samoobnavljanja in diferenciacije v različne limfo-hematopoetične celice, so HSC (Hematopoietic stem cells) obetavne za gensko terapijo. Sprva so za stabilen vnos genov v HSC uporabili ''SB'' transpozon zgodnje generacije (SB10); učinkovitost je bila relativno majhna in niso našli nobenih dokazov, ki bi podpirali učinkovito hematopoetično rekonstrukcijo in 'multi-lineage marking' ''in vivo''. To jim je kasneje uspelo v transpozonsko modificiranih CD34<sup>+</sup> HSC z uporabo SB100X sistema. Pokazali so, da se sposobnost za stabilno dostavo genov v CD34<sup>+</sup> HSC lahko raztegne tudi na ''PB'' sistem, vendar je bil SB100X bolj učinkovit. Da pa bi lahko z gotovostjo rekli, kateri sistem je boljši, bi bila potrebna primerjalna študija še z zadnjo generacijo hyPBaz (ang. “hyper-active PBaze”).

	==''piggyBac''==		==''piggyBac''==

Jan Kogovšek: /* HSC (Hematopoietic Stem Cells) */

2022-04-26T12:29:56Z

HSC (Hematopoietic Stem Cells)

← Older revision		Revision as of 12:29, 26 April 2022
Line 38:		Line 38:
	===HSC (Hematopoietic Stem Cells)===		===HSC (Hematopoietic Stem Cells)===

	Zaradi zmožnosti samoobnavljanja in diferenciacije v različne limfo-hematopoetične celice, so HSC (Hematopoietic stem cells) obetavne za gensko terapijo. Sprva so za stabilen vnos genov v HSC uporabili ''SB'' transpozon zgodnje generacije (SB10); učinkovitost je bila relativno majhna in niso našli nobenih dokazov, ki bi podpirali učinkovito hematopoetično rekonstrukcijo in 'multi-lineage marking' ''in vivo''. To jim je kasneje uspelo v transpozonsko modificiranih CD34+ HSC z uporabo SB100X sistema. Pokazali so, da se sposobnost za stabilno dostavo genov v CD34+ HSC lahko raztegne tudi na PB sistem, vendar je bil SB100X bolj učinkovit. Da pa bi lahko z gotovostjo rekli, kateri sistem je boljši, bi bila potrebna primerjalna študija še z zadnjo generacijo hyPBaz (ang. “hyper-active PBaze”).		Zaradi zmožnosti samoobnavljanja in diferenciacije v različne limfo-hematopoetične celice, so HSC (Hematopoietic stem cells) obetavne za gensko terapijo. Sprva so za stabilen vnos genov v HSC uporabili ''SB'' transpozon zgodnje generacije (SB10); učinkovitost je bila relativno majhna in niso našli nobenih dokazov, ki bi podpirali učinkovito hematopoetično rekonstrukcijo in 'multi-lineage marking' ''in vivo''. To jim je kasneje uspelo v transpozonsko modificiranih CD34+ HSC z uporabo SB100X sistema. Pokazali so, da se sposobnost za stabilno dostavo genov v CD34<sup>+</sup> HSC lahko raztegne tudi na ''PB'' sistem, vendar je bil SB100X bolj učinkovit. Da pa bi lahko z gotovostjo rekli, kateri sistem je boljši, bi bila potrebna primerjalna študija še z zadnjo generacijo hyPBaz (ang. “hyper-active PBaze”).

	==''piggyBac''==		==''piggyBac''==