User:AnaKodra - Revision history

AnaKodra: /* =Viri */

2023-04-15T19:05:33Z

=Viri

← Older revision		Revision as of 19:05, 15 April 2023
Line 36:		Line 36:
	V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.		V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.

	==Viri=		==Viri==
	[1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.		[1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.

AnaKodra: /* =Viri */

2023-04-15T19:05:19Z

=Viri

← Older revision		Revision as of 19:05, 15 April 2023
Line 38:		Line 38:
	==Viri=		==Viri=
	[1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.		[1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.

	[2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.		[2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.

	[3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.		[3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.

	[4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.		[4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.

	[5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.		[5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.

AnaKodra at 19:05, 15 April 2023

2023-04-15T19:05:03Z

← Older revision		Revision as of 19:05, 15 April 2023
Line 35:		Line 35:
	==Zaključek==		==Zaključek==
	V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.		V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.

			==Viri=
			[1] Y. Qin, S.-H. You, Y. Zhang, A. Venu, Y. Hong, J.-J. Min: Genetic Programming by Nitric Oxide-Sensing Gene Switch System in Tumor-Targeting Bacteria. Biosensors (Basel) 2023, 13, 266.
			[2] M. T.-Q. Duong, Y. Qin, S.-H. You, J.-J. Min: Bacteria-Cancer Interactions: Bacteria-Based Cancer Therapy. Exp Mol Med 2019, 51, 1–15.
			[3] Q. Xue, Y. Yan, R. Zhang, H. Xiong: Regulation of INOS on Immune Cells and Its Role in Diseases. Int J Mol Sci 2018, 19, 3805.
			[4] A. M. Gardner, C. R. Gessner, P. R. Gardner: Regulation of the Nitric Oxide Reduction Operon (NorRVW) in Escherichia Coli. Journal of Biological Chemistry 2003, 278, 10081–10086.
			[5] W. R. Schwan: Regulation of Fim Genes in Uropathogenic Escherichia Coli. World J Clin Infect Dis 2011, 1, 17.

AnaKodra: /* Rezultati */

2023-04-15T19:04:06Z

Rezultati

← Older revision		Revision as of 19:04, 15 April 2023
Line 18:		Line 18:
	==Rezultati==		==Rezultati==
	<u>Rezultati ''in vitro''</u>		<u>Rezultati ''in vitro''</u>

	Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''.		Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''.

Line 23:		Line 24:

	<u>Rezultati ''in vivo''</u>		<u>Rezultati ''in vivo''</u>

	Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10<sup>7</sup> CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje.		Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10<sup>7</sup> CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje.

Line 29:		Line 31:
	Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.		Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.

	Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.		Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.

	==Zaključek==		==Zaključek==
	V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.		V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.

AnaKodra: /* Rezultati */

2023-04-15T19:03:45Z

Rezultati

← Older revision		Revision as of 19:03, 15 April 2023
Line 18:		Line 18:
	==Rezultati==		==Rezultati==
	<u>Rezultati ''in vitro''</u>		<u>Rezultati ''in vitro''</u>
			Delovanje stikalnega sistema so najprej potrdili ''in vitro''. V ta namen so kot vir NO uporabili mešanico dietilentriamin/NO, ki so jo pri različnih koncentracijah dodali v gojišče. Transformirane bakerije so gojili 16 h pri 37°C, dodali substrat za Rluc8 in izmerili intenziteto bioluminiscence. Le-to so nato normirali glede na izmerjeno optično gostoto pri 600 nm in potrdili, da pri višjih koncentracijah NO dobljen signal narašča. Kot negativno kontrolo so uporabili bakterije, ki so jih transformirali samo s plazmidom pSRluc8. V tem primeru bioluminiscence niso zaznali niti pri najvišjih koncentracijah NO, kar pomeni, da do izražanje Rluc8 ni prišlo. To se je ujemalo s pričakovanji, saj bakterije niso vsebovale zapisa za FimE, ki bi lahko invertiral promotorsko zaporedje v ''fimS''.

			V nadaljevanju so želeli preveriti, ali je aktivacija stikalnega sistema ireverzibilna. V ta namen so bakterije čez noč gojili v gojišču z znano koncentracijo dietilentriamina/NO in jih nato naslednji dan prenesli v gojišče, kjer NO ni bil prisoten. V naslednjih 72 urah so odvzemali vzorce in merili intenziteto bioluminiscence ter jo ponovno normirali glede na OD600. Dobljen signal je bil približno 200-krat močnejši kot pri negativni kontroli. To je potrdilo, da je stikalni sistem ireverzibilno v aktivnem stanju tudi po izgubi stimulacije z NO. Poleg tega se aktivno stanje stikalnega sistema prenaša s celično delitvijo na hčerinske celice.

			<u>Rezultati ''in vivo''</u>
			Za in vivo eksperimente so uporabili Balb/C miši, ki so jim v podkožje implantirali tumorske celice linije CT-26. Najprej so želeli preveriti, ali bakterije ''S''. Typhimurium, transformirane s plazmidoma pSRluc8 in pFimE, specifično kolonizirajo tumorje in sprožijo imunski odziv v miših. V miši so injicirali 1*10<sup>7</sup> CFU bakterij in miši čez 1, 3, 5, 7 ali 11 dni evtanazirali. V izoliranih tumorjih so določili število bakterij ''S''. Typhimurium naredili primerjavo s tremi zdravimi organi (pljuča, vranica, jetra), ki so služili kot kontrola selektivnosti kolonizacije. Že prvi dan po injiciranju bakterij je bilo njihovo število v tumorjih približno 10 000-krat višje kot v kontrolnih organih. Z podaljševanjem časa med injiciranjem bakterij in evtanazijo miši je število bakterij v tumorju in kontrolnih organih padalo, vendar je bilo tudi na 11. dan v tumorju število bakterij višje.

			Sprožitev imunskega odziva v miši so določali z merjenjem koncentracije provnetnih citokinov IFN-γ, TNF-α in IL-1β v tumorskem tkivu. V ta namen so uporabili test ELISA. Meritve so izvajali 1,3,5 in 7 dni po injiciranju bakterij. Kot negativno kontrolo so v miši injicirali PBS. Koncentracija TNF-α in IL-1β je bila višja kot pri negativni kontroli že po enem dnevu, medtem ko je bila koncentracija IFN-γ višja od negativne kontrole šele po treh dneh. S časom so koncentracije vseh treh citokinov padale, vendar so bile tudi na sedmi dan še vedno višje kot pri negativni kontroli.

			Nato so želeli preveriti, ali je možno stikalni sistem uporabiti za tarčno ''in vivo'' dostavo genov na mesto tumorja. V ta namen so miši injicirali s plazmidoma pSRluc8 in pFimE ali zgolj z pSRluc8 (negativna kontrola). Pred meritvijo intenzitete bioluminiscence so mišim injicirali tudi koelenterazin. Intenziteta bioluminiscence na mestu tumorja je naraščala do sedmega dneva po injiciranju bakterij transformiranih z obema plazmidoma. Razlika v primerjavi z negativno kontrolo je bila v tem časovnem intervalu statistično signifikantna. To pomeni, da je stikalni sistem ostal aktiven oz. da je prišlo do izražanja reporterskega gena tudi, ko so koncentracije provnetnih citokinov že začele upadati.

			Nazadnje so želeli preveriti še, ali je NO v tumorskem mikrookolju posledica delovanja inducibilne NO sintaze. Tri dni pred injiciranjem bakterij, transformiranih z obema plazmidoma, so začeli mišim vsakodnevno intraperitonalno vnašati inhibitor iNOS, imenovan 1400W dihidroklorid. Inhibitor so vsakodnevno vnašali tudi po injiciranju bakterij. Kot kontrolo so uporabili miši, ki so jim injicirali bakterije, ne pa tudi inhibitorja. Bioluminiscenčni signal so merili 3, 5, 7 in 9 dni po injeciranju bakterij. Vse dni merjenja je bila ntenziteta bioluminiscence višja pri miših brez inhibitorja iNOS. S tem so potrdili, da je inducibilna NO sintaza sintetizirala NO, ki je aktiviral stikalni sistem.

			==Zaključek==
			V članku so v organizmu ''Salmonella enterica'' podvrsti ''enterica'' serotipu Typhimurioum zasnovali stikalni sistem, ki se odziva na NO. Funkcionalnost stikalnega sistema so potrdili ''in vitro'', kjer se je odzival na kemijski vir NO, ki je sprožil ireverzibilno aktivacijo stikalnega sistema. Aktivacija se je ohranila tudi po odvzemu NO iz gojišča, pri celični delitvi pa se je prenesla na hčerinske celice. ''In vivo'' so potrdili, da ''S''. Typhimurioum, ki nosijo zapis za stikalni sistem, specifično kolonizirajo tumorsko tkivo. Stikalni sistem se je v tem primeru specifično aktiviral z NO, ki ga je sintetizirala inducibilna NO sintaza. Rezultati raziskave namigujejo, da bi v prihodnosti lahko izkoristili NO kot inducer za tarčno dostavo genov oz. proteinov, ki jih zapisujejo, do mesta tumorjev. Na ta način se nam odpira možnost za razvoj novih dostavnih sistemov za zdravljenje raka.

AnaKodra: /* Rezultati */

2023-04-15T18:57:18Z

Rezultati

← Older revision		Revision as of 18:57, 15 April 2023
Line 17:		Line 17:

	==Rezultati==		==Rezultati==
	~~{{underline\|~~Rezultati ''in vitro''}}		<u>Rezultati ''in vitro''</u>

AnaKodra at 18:56, 15 April 2023

2023-04-15T18:56:17Z

← Older revision		Revision as of 18:56, 15 April 2023
Line 15:		Line 15:

	NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.		NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.

			==Rezultati==
			{{underline\|Rezultati ''in vitro''}}

AnaKodra: /* Princip delovanja stikalnega sistema */

2023-04-15T18:54:17Z

Princip delovanja stikalnega sistema

← Older revision		Revision as of 18:54, 15 April 2023
Line 9:		Line 9:
	Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.		Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.
	Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N<sub>2</sub>O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ<sup>54</sup> podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno.		Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N<sub>2</sub>O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ<sup>54</sup> podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno.

	Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja.		Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja.

	Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P<sub>norV</sub> iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P<sub>lacIq</sub>. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo.		Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P<sub>norV</sub> iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P<sub>lacIq</sub>. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo.

	NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.		NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.

AnaKodra at 18:53, 15 April 2023

2023-04-15T18:53:04Z

← Older revision		Revision as of 18:53, 15 April 2023
Line 8:		Line 8:
	==Princip delovanja stikalnega sistema==		==Princip delovanja stikalnega sistema==
	Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.		Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.
	Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N<sub>2</sub>O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana norV in norW, sta del operona norRVW, kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo ~~σ54~~ podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno.		Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N<sub>2</sub>O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana ''norV'' in ''norW'', sta del operona ''norRVW'', kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ<sup>54</sup> podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno.
	Operon fim so odkrili v patogenem sevu E. coli, ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano fimS. FimS vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja fimS se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje fimS proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje fimS samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja.		Operon ''fim'' so odkrili v patogenem sevu ''E. coli'', ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano ''fimS''. ''FimS'' vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja ''fimS'' se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje ''fimS'' proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje ''fimS'' samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja.
	Za pripravo bakterij S. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor ~~PnorV~~ iz operona norRVW ter rekombinazo FimE in zaporedje fimS iz operona fim. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja ~~PlacIq~~. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma Renilla, imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju fimS, ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo.		Za pripravo bakterij ''S''. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor P<sub>norV</sub> iz operona ''norRVW'' ter rekombinazo FimE in zaporedje ''fimS'' iz operona ''fim''. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja P<sub>lacIq</sub>. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma ''Renilla'', imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju ''fimS'', ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo.
	NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju fimS, kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.		NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju ''fimS'', kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.

AnaKodra at 18:48, 15 April 2023

2023-04-15T18:48:23Z

← Older revision		Revision as of 18:48, 15 April 2023
Line 5:		Line 5:
	==Uvod==		==Uvod==
	V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.		V mikrookolju tumorja se poleg tumorskih celic nahajajo tudi številne druge. V kontekstu izbranega članka je ključno omeniti predvsem bakterije in pa imunske celice. Analize bakterijskih populacij so razkrile, da tumorje kolonizirajo predvsem vrste iz rodov ''Clostridium'', ''Bifidobacterium'', ''Listeria'', ''Escherichia'' in ''Salmonella''. Pri slednji je potrebno izpostaviti organizem ''Salmonella enterica'' podvrsto ''enterica'' serotip Typhimurium, ki v primerjavi z zdravimi tkivi tumorje naseljuje zelo selektivno in v velikem številu. V tumorskem mikrookolju lahko lipopolisaharidi bakterij in provnetni citokini v imunskih celicah, predvsem makrofagih, inducirajo izražanje inducibilne NO sintaze (iNOS). Le-ta katalizira pretvorbo L-arginina v L-citrulin, pri čemer se tvori tudi NO. Avtorji članka so poskusili zasnovati nov način tarčnega dostavljanja izbranih genov do tumorskega tkiva. V ta namen so v ''S''. Typhimurium pripravili stikalni sistem, ki se odziva na NO v tumorskem mikrookolju.

			==Princip delovanja stikalnega sistema==
			Za razumevanje delovanja stikalnega sistema, ki bo opisan v nadaljevanju, si najprej poglejmo regulator NorR in operon ''fim''.
			Bakterija ''Escherichia coli'' se lahko zaščiti pred povišanimi koncentracijami NO v okolju tako, da začne sintetizirati encim NO reduktazo, ki reducira NO do manj reaktivnega N<sub>2</sub>O, ki ne more poškodovati celice. Strukturna gena za NO reduktazo, imenovana norV in norW, sta del operona norRVW, kjer sta pod kontrolo inducibilnega promotorja. Navzgor od le-tega se nahaja zapis za regulator NorR, ki je sestavljen iz treh domen. V odsotnosti NO se NorR preko DNA vezavne domene na C-koncu veže na ojačevalna zaporedja na DNA. Pri tem N-končna domena zavzame konformacijo, ki preprečuje vezavo σ54 podenote RNA polimeraze na osrednjo domeno NorR. Geni za NO reduktazo se torej v tem primeru ne izražajo. N-končna domena NorR vsebuje vezavno mesto za NO. Če je NO vezan na NorR, N-končna domena ne preprečuje več vezave RNA polimeraze in prepisovanje genov je možno.
			Operon fim so odkrili v patogenem sevu E. coli, ki povzroča okužbo sečil. Sestavljen je iz sedmih strukturnih genov, ki zapisujejo za proteine pilusov tipa 1. Navzgor of strukturnih genov se nahaja zaporedje, imenovano fimS. FimS vsebuje promotorsko zaporedje, ki ga obdajata leva in desna obrnjena ponovitev (IRL oz. »inverted repeat left« in IRR oz. »inverted repreat right«). Navzgor od zaporedja fimS se pod kontrolo konstitutivnih promotorjev nahajata še zapisa za rekombinazi FimB in FimE. V neaktivnem stanju (stanje »OFF«), ko do izražanja strukturnih genov ne prihaja, je promotorsko zaporedje usmerjeno v nasprotno smer od strukturnih genov, proti IRL. Do aktivacije (stanje »ON«) pride, ko rekombinaza FimB invertira zaporedje fimS proti IRR tako, da promotorsko zaporedje omogoča prepisovanje strukturnih genov. Preklop v neaktivno stanje lahko izvede bodisi FimB bodisi FimE, ki invertira promotorsko zaporedje tako, da je ponovno usmerjeno proti IRL. Ključno je predvsem to, da lahko FimE invertira promotorsko zaporedje fimS samo, če je usmerjeno proti IRR. FimE torej v odsotnosti FimB, ki bi lahko vrnil sistem v prvotno stanje, katalizira ireverzibilno inverzijo promotorskega zaporedja.
			Za pripravo bakterij S. Typhimurium, ki se bodo odzivale na NO, so uporabili zapise za regulator NorR in inducibilni promotor PnorV iz operona norRVW ter rekombinazo FimE in zaporedje fimS iz operona fim. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma, ki so ju poimenovali pSRluc8 in pFimE. pFimE je vseboval zapis za rekombinazo FimE pod kontrolo inducibilnega promotorja PnorV. Zapis za regulatorni protein NorR se je nahajal na plazmidu pSRluc8 in je bil pod kontrolo konstitutivnega promotorja PlacIq. Na plazmidu pSRluc8 se je nahajal tudi zapis za reporterski protein, ki je bila v tem primeru ena od variant luciferaze iz organizma Renilla, imenovana Rluc8. Rluc8 je bil pod kontrolo promotorja v zaporedju fimS, ki pa je bil v plazmid vstavljen tako, da je bilo promotorsko zaporedje usmerjeno proti IRL in v nasprotno smer kot zapis za reporterski protein. Pri tako opisani orientaciji do izražanja reporterskega gena naj ne bi prihajalo.
			NorR naj bi se v celicah konstitutivno izražal. Ko bi bil NO prisoten, naj bi se vezal na NorR in omogočil vezavo RNA polimeraze, kar bi sprožilo prepisovanje zaporedja za FimE na plazmidu pFimE. Rekombinaza FimE naj bi nato katalizirala inverzijo promotorskega zaporedja v zaporedju fimS, kar bi omogočilo izražanje luciferaze Rluc8 na plazmidu pSRluc8. Ob prisotnosti NO in substrata koelenterazina bi torej morali zaznali bioluminiscenčni signal.