VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z Vibrio natriegens - Revision history

Tadej Satler: /* Metabolni inžiniring */

2019-01-14T23:22:47Z

Metabolni inžiniring

← Older revision		Revision as of 23:22, 14 January 2019
Line 54:		Line 54:
	== '''Metabolni inžiniring''' ==		== '''Metabolni inžiniring''' ==

	Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost ~~pri metabolnem inžiniringu~~. ~~Želeli~~ so ~~pospešiti metabolizem~~ s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.		Zaradi velike genetske dostopnosti, hitre rasti in visoke absorpcije substratov ''V. natriegens'', je študentska ekipa želela predstaviti tudi njeno primernost za metabolni inžiniring. V celice so uvedli novo sintezno pot ter pospešili sintezo s predstavitvijo poteka dela, ki omogoča hitro konstrukcijo metabolnih poti, pregledovanje produktov in optimizacijo procesa.

	Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.		Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

Tadej Satler: /* VibriExpress */

2019-01-14T23:15:50Z

VibriExpress

← Older revision		Revision as of 23:15, 14 January 2019
Line 44:		Line 44:
	=== '''VibriExpress''' ===		=== '''VibriExpress''' ===

	Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije ~~zapisov~~ za ~~proteazi~~ Lon ~~in OmpT~~. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.		Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisa za proteazo Lon. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

	=== '''VibriInteract''' ===		=== '''VibriInteract''' ===

Tadej Satler: /* Priprava sevov */

2019-01-14T23:12:41Z

Priprava sevov

← Older revision		Revision as of 23:12, 14 January 2019
Line 32:		Line 32:
	== '''Priprava sevov''' ==		== '''Priprava sevov''' ==

	V laboratorijih uporabljamo ~~različne seve ''E. coli''~~ za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.		V laboratorijih uporabljamo za metode kloniranja, proteinske ekspresije ali določanja proteinskih interakcij različne seve ''E. coli''. Analogno so pri projektu Vibrigens pripravili 3 različne seve ''V. natriegens'', ki so osnovani na genotipih pogosto uporabljenih ''E. coli'' sevov.

	=== '''VibriClone''' ===		=== '''VibriClone''' ===

Tadej Satler: /* Zbirka Marburg */

2019-01-14T23:08:12Z

Zbirka Marburg

← Older revision		Revision as of 23:08, 14 January 2019
Line 16:		Line 16:
	== '''Zbirka Marburg''' ==		== '''Zbirka Marburg''' ==

	Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na ~~destinacijski plazmid~~.		Čeprav so v raziskavi Weinstock et al. 2016 <ref name="peti">M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.</ref> pokazali, da lahko pri ''V. natriegens'' uporabljamo več komercialno dostopnih plazmidov, je ekipa iz Marburga pripravila zbirko plazmidov z več kot 120 osnovnimi genetskimi deli, ki omogočajo de novo sestavljanje plazmidov za uporabo v ''V. natriegens'' ter tudi kateri drugi bakteriji. Pri načrtovanju zbirke so se zgledovali po že znanih bakterijskih zbirkah, kot sta EcoFlex in PhytoBrick. Ti sta osnovani na metodi »golden gate« in omogočata sestavljanje posameznih transkripcijski enot ter njihovo združevanje na destinacijskem plazmidu.

	Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem de novo sestavljanje plazmida ~~namesto uporabe~~ destinacijskih vektorjev, ~~kot je to~~ pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na ORI~~-mesto~~ in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.		Prednost zbirke Marburg je njena fleksibilnost. Zbirka omogoča povsem ''de novo'' sestavljanje plazmida s čimer se izognemo uporabi destinacijskih vektorjev, ki jih potrebujemo pri drugih zbirkah. Tako pri pripravi plazmida nismo omejeni na mesto ORI in zapis za rezistenco na antibiotik, ki se nahajata na destinacijskem vektorju, temveč lahko pripravimo celoten plazmid kompatibilen tarčnemu organizmu. Najosnovnejši genetski deli so shranjeni na plazmidih ničte ravni in omogočajo združevanje v transkripcijko enoto, kar privede do plazmida prve ravni. Uporaba plazmidov prve ravni pa omogoča pripravo multigenskega konstrukta – plazmida druge ravni, ki vsebuje več transkripcijskih enot <ref name="prvi" />.

	== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==		== '''Urejanje genoma – FLP/FRP''' ==

Tadej Satler: /* Vibrio natriegens */

2019-01-13T22:35:12Z

Vibrio natriegens

← Older revision		Revision as of 22:35, 13 January 2019
Line 12:		Line 12:
	Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.		Za ''V. natriegens'' je značilna naravna kompetenca - sposobnost sprejemanja DNA iz okolja, ki jo regulira Tfox. TfoX je značilen za številne bakterije roda Vibrio, omogoča pa sprejemanje in genomsko integracijo DNA delcev preko homologne rekombinacije. Za razliko od večine ostalih bakterij iz roda, pa pri ''V. natriegens'' Tfox ni induciran v prisotnosti hitina, temveč je vzrok induciranja neznan. Zato je za uspešno delovanje sistema bilo potrebno TfoX postaviti pod kontrolo inducibilnega promotorja (npr. IPTG) <ref name="prvi" />.

	Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. ~~»multiplex~~ genome editing by natural ~~transformation«~~) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.		Leta 2017 so raziskovalci za ''V. natriegens'' predstavili metodo MuGENT (angl. »''multiplex genome editing by natural transformation''«) <ref name="četrti">T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017</ref>, ki omogoča urejanje genoma na več mestih hkrati z uporabo le enega zapisa za rezistenco na antibiotik. Pri uporabi metode predpostavljamo, da ob induciranju kompetence, obstaja znotraj populacije le manjša skupina bakterij, ki je sposobna sprejeti DNA verigo, hkrati pa lahko te bakterije sprejemajo in integrirajo več verig DNA hkrati. Celice v procesu inkubiramo z linearno selektivno DNA, ki v genom uvede rezistenco na antibiotik, ter neselektivno DNA, ki uvaja izbrane genomske spremembe na enem ali več lokusih <ref name="prvi" />.

	== '''Zbirka Marburg''' ==		== '''Zbirka Marburg''' ==

Tadej Satler: /* VibriClone */

2019-01-13T22:34:45Z

VibriClone

← Older revision		Revision as of 22:34, 13 January 2019
Line 36:		Line 36:
	=== '''VibriClone''' ===		=== '''VibriClone''' ===

	Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.		Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature <ref name="prvi" />. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

	Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.		Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Tadej Satler: /* Viri */

2019-01-13T22:34:10Z

Viri

← Older revision		Revision as of 22:34, 13 January 2019
Line 67:		Line 67:

	<references/>		<references/>

	~~[1] iGEM 2018 team Marburg. VibriGens. 17.10.2018. [citirano 10.01.2018] http://2018.igem.org/Team:Marburg~~

	~~[2] Vibrio natriegens. 16.11.2018 [citirano 10.01.2018] https://en.wikipedia.org/wiki/Vibrio_natriegens~~

	~~[3] Todar, Kenneth Gregory. Todar's Online Textbook of Bacteriology. Madison, WI: Kenneth Todar, University of Wisconsin-Madison Dept. of Bacteriology, 2006.~~

	[4] T. Dalia, C. Hayes, S. Stolyar, C. Marx, J. McKinlay and A. Dalia, "Multiplex Genome Editing by Natural Transformation (MuGENT) for Synthetic Biology in Vibrio natriegens", ACS Synthetic Biology, vol. 6, no. 9, pp. 1650-1655, 2017

	~~[5] M. Weinstock, E. Hesek, C. Wilson and D. Gibson, "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology", Nature Methods, vol. 13, no. 10, pp. 849-851, 2016.~~

	~~[6] M. Blokesch, "TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination", Journal of Visualized Experiments, no. 68, 2012.~~

Tadej Satler: /* Metabolni inžiniring */

2019-01-13T22:33:58Z

Metabolni inžiniring

← Older revision		Revision as of 22:33, 13 January 2019
Line 58:		Line 58:
	Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.		Za izgradnjo knjižnice plazmidov z zapisi za encime metabolnih poti, so uporabljali zbirko Marburg. Za pregledovanje produktov in določanje obetavnih poti pa so uporabljali biosenzorje ter se tako izognili časovno potratni kromatografiji.

	Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline ~~[1]~~.		Kot biosenzorje so pripravili plazmide z zapisi za reporterske proteine (npr. GFP) ter transkripcijske faktorje, ki so odzivni na ustrezne metabolite. Plazmide so transformirali v celice, kar je omogočalo kvantitativno določanje količine ustreznega metabolita. Učinkovitost celotnega pristopa so tudi pokazali s kreacijo in optimizacijo sintezne poti 3-hidroksipropionske kisline <ref name="prvi" />.

	== '''Zaključek''' ==		== '''Zaključek''' ==

Tadej Satler: /* Priprava sevov */

2019-01-13T22:33:26Z

Priprava sevov

← Older revision		Revision as of 22:33, 13 January 2019
Line 36:		Line 36:
	=== '''VibriClone''' ===		=== '''VibriClone''' ===

	Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti">, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.		Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti" />, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

	Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.		Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

Tadej Satler: /* Priprava sevov */

2019-01-13T22:32:31Z

Priprava sevov

← Older revision		Revision as of 22:32, 13 January 2019
Line 36:		Line 36:
	=== '''VibriClone''' ===		=== '''VibriClone''' ===

	Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali ~~[5]~~, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.		Pri zgledovanju po ''E. coli'', so za ustrezen klonirni sev ''V. natriegens'' potrebne številne modifikacije genoma. Ena izmed teh je izbitje gena za eksonukleaze, ki bi lahko razgradile transformirano DNA. Nukleazi prisotni pri ''V. natriegens'' sta Dns, ki je homologna EndA iz ''E. coli'', in ExeM. Obe nukleazi se sproščata v medij, zato je njuno izbitje povečalo učinkovitost transformacije v primerjavi z divjim tipom. Delecijo Dsn so naredili s prej opisano kaseto, ki zapisuje za odpornost na kloramfenikol, delecijo ExeM pa so opravili z vstavitvijo neselektivnega zapisa za gen katG. Ta zapisuje za encim s katalazno in peroksidazno aktivnostjo, ki z odstranjevanjem toksičnega peroksida zmanjša občutljivost na hladne temperature. Raziskovalci so že dokazali <ref name="peti">, da je izražanje KatG podaljša čas shranjevanja v hladilniku do treh tednov.

	Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.		Za preprečevanje nezaželene homologne rekombinacije med genomom in plazmidi, je smiselno preprečit delovanje encima RecA. Za izgubo funkcije je dovolj točkovna mutacija, ki spremeni glicina na mestu 158 v aspartat. Pripravili so neselektivno kaseto z zapisom za RecA s točkovno mutacijo ter jo prenesli v genom.

	Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α ~~[1]~~.		Za omogočanje modro-belega testa so v genom vstavili tudi laktozni operon brez lacZ α podenote iz E.coli seva DH5α <ref name="prvi" />.

	=== '''VibriExpress''' ===		=== '''VibriExpress''' ===

	Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo ~~[1]~~.		Študentska ekipa je ekspresijski sev ''V. natriegens'' modelirala po sevu ''E. coli'' BL21 (DE3). Gre za sev, ki je pogosto izbran za ekspresijo proteinov ter s svojimi modifikacijami omogoča inducibilno izražanje ter visoke izkoristke izolacije. Osredotočili so se predvsem na integracijo T7 RNA polimeraznega gena v genom ''V. natriegens'' ter delecije zapisov za proteazi Lon in OmpT. Vse modifikacije so bile opravljene s homologno rekombinacijo <ref name="prvi" />.

	=== '''VibriInteract''' ===		=== '''VibriInteract''' ===
Line 50:		Line 50:
	Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.		Za razumevanje biokemijskih procesov nekega proteina, je poleg osnovne karakterizacije pomembno tudi poznavanje proteinskih interakcijskih partnerjev. Ekipa je pripravila tudi sev ''V.'' ''natriegens'' - VibriInteract, ki omogoča uporabo najhitreje rastoče bakterije za študije proteinskih interakcij. Prepoznavanje interakcijskih partnerjev temelji na dvohibridnem sistemu, ki ga pri kvasovkah in bakterijah že poznamo, vendar bo z uporabo ''V. natriegens'' celoten proces precej manj časovno potraten. Bakterijski dvohibridni sistem je osnovan na rekonstrukciji signalne poti, ki je odvisna od adenilat ciklaze (CyaA). CyaA je regulator v celicah kot so ''E. coli'', kjer katalizira pretvorbo ATP v cAMP. cAMP pa s tvorbo kompleksa cAMP/CAP deluje kot pozitivni regulator mal in lac operona.

	Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša ~~[1]~~.		Pri pripravi seva je bilo potrebno izvesti genomsko delecijo gena cyA, ki kodira za katalitično domeno adenilat ciklaze. Izvedba eksperimenta nato poteka z uporabo komercialno dostopnih komplementarnih fragmentov T25 in T18 katalitične domene adenilat ciklaze. Fragmente v celici izražamo s fuzijskimi partnerji in v primeru, da pride do proteinske interakcije, bo prišlo do sinteze cAMP ter posledično bodo lahko celice porabljale maltozo in laktozo. Primerjali so VibriInteract z ''E. coli'' sevom BTH101, ki se navadno uporablja za študije interakcij, ter dokazali, da rast VibriInteracta veliko hitrejša <ref name="prvi" />.

	== '''Metabolni inžiniring''' ==		== '''Metabolni inžiniring''' ==