Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini - Revision history

Mojca Kostanjevec: /* Viri */

2017-01-02T12:56:33Z

Viri

← Older revision		Revision as of 12:56, 2 January 2017
Line 91:		Line 91:


	Seminarji SB 2016/17		[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Seminarji_SB_12016/17 Seminarji SB 2016/17]

Mojca Kostanjevec at 12:55, 2 January 2017

2017-01-02T12:55:29Z

← Older revision		Revision as of 12:55, 2 January 2017
Line 78:		Line 78:
	[1] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21920446 Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011)]		[1] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21920446 Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011)]

	[2] van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).		[2] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11598960 van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001)]

	[3] Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).		[3] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19104498 Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009)]

	[4] Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).		[4] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17289589 Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007)]

	[5] Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).		[5] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27144967 Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016)]

	[6] 2016 iGEM ~~team from~~ Eindhoven ~~University of Technology~~		[6] [http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

	----		----

Mojca Kostanjevec at 12:52, 2 January 2017

2017-01-02T12:52:40Z

← Older revision		Revision as of 12:52, 2 January 2017
Line 76:		Line 76:
	== Viri ==		== Viri ==

	[1] Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).		[1] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21920446 Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011)]

	[2] van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).		[2] van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
Line 89:		Line 89:

	----		----


	Seminarji SB 2016/17		Seminarji SB 2016/17

Mojca Kostanjevec at 12:50, 2 January 2017

2017-01-02T12:50:22Z

← Older revision		Revision as of 12:50, 2 January 2017
Line 72:		Line 72:

	Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.		Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.


	== Viri ==		== Viri ==

	1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).		[1] Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).

			[2] van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).

			[3] Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).

	~~2. van Hemert~~, M. ~~J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H~~. 14-3-3 ~~proteins: key regulators~~ of ~~cell division, signalling~~ and ~~apoptosis~~. ~~BioEssays 23~~, ~~936–946~~ (~~2001~~).		[4] Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).

	~~3. Shaw~~, ~~A. S~~. & ~~Filbert~~, E. L. ~~Scaffold proteins and immune-cell signalling~~. ~~Nat. Rev. Immunol. 9~~, ~~47–56~~ (~~2009~~).		[5] Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).

	~~4. Ottmann, C. et al. Structure~~ of ~~a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).~~		[6] 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

	~~5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).~~		----

	6. 2016 ~~iGEM team from Eindhoven University of Technology~~		Seminarji SB 2016/17

Mojca Kostanjevec at 12:48, 2 January 2017

2017-01-02T12:48:56Z

← Older revision		Revision as of 12:48, 2 January 2017
Line 65:		Line 65:

	Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.		Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.


	== Zaključek ==		== Zaključek ==
Line 75:		Line 76:

	1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).		1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).

	2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).		2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).

	3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).		3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).

	4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).		4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).

	5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).		5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).

	6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology		6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Mojca Kostanjevec: /* Zaključek */

2017-01-02T12:48:28Z

Zaključek

← Older revision		Revision as of 12:48, 2 January 2017
Line 71:		Line 71:

	Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.		Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.


	== Viri ==		== Viri ==

Mojca Kostanjevec: /* Tetrameri T14-3-3 */

2017-01-02T12:47:30Z

Tetrameri T14-3-3

← Older revision		Revision as of 12:47, 2 January 2017
Line 64:		Line 64:
	Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.		Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

	Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).		Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

	Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.


	== Zaključek ==		== Zaključek ==

Mojca Kostanjevec: /* Dimeri T14-3-3 */

2017-01-02T12:46:42Z

Dimeri T14-3-3

← Older revision		Revision as of 12:46, 2 January 2017
Line 52:		Line 52:
	V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.		V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

	Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.		Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

	V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

	V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.		V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

Mojca Kostanjevec at 12:45, 2 January 2017

2017-01-02T12:45:30Z

← Older revision		Revision as of 12:45, 2 January 2017
Line 27:		Line 27:
	Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.		Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

	Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H ~~ter~~ S953K, ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.		Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

	==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====		==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Mojca Kostanjevec at 12:44, 2 January 2017

2017-01-02T12:44:45Z

← Older revision		Revision as of 12:44, 2 January 2017
Line 69:		Line 69:

	Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.		Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.


	== Zaključek ==		== Zaključek ==