Ponovna aktivacija kromosoma X

Inaktivacija enega od kromosomov X je pomemben proces v celicah ženskih sesalcev, saj poskrbi za to da med spoloma ne prihaja do razlik v količini izraženih genov zapisanih na kromosomu X. Ko enkrat kromosom X postane neaktiven, se njegova oblika ne spreminja več in tak ostane celotno življenjsko obdobje celice. Spolne celice so v tem smislu izjema. Med njihovim nastajanjem se mora neaktiven kromosom X ponovno aktivirati, tako zrele oocite (ženske spolne celice) vsebujejo oba aktivna kromosoma X. Pomembno vlogo v procesu aktivacije in njegovem mehanizmu imata nekodirajoča RNA Tsix in protein Rnf12. Ponovna aktivacija kromosoma X je še dokaj nepoznan proces, a vzbuja vse večjo pozornost pri umetnem reprogramiranju somatskih celic v inducirane pluripotentne celice, ki ponuja njihovo uporabo v zdravstvene namene.

Zgodnji embrionalni razvoj

Pri prenosu genskih informacij pride v prvi stopnji do združitve gamet (spolnih celic). Po združitvi haploidnega jajčeca in semenčica (n) nastane diploidna zigota (2n). Zanjo je značilno da po materi vedno prenese oz. podeduje X kromosom medtem ko lahko po očetu podeduje bodisi X ali Y kromosom. Tako nastala zigota se razvije v blastocisto. Zunanjo plast celic, ki se kasneje razvije v izvenembrionalne celice (posteljico) imenujemo trofoblast, pri tem nastalo votlino pa epiblast. Znotraj epiblasta se nahajajo celice notranje celične mase (ICM cells). Omenjene celice se v nadaljnjem razvoju delijo v dve celični liniji, in sicer embrionalne matične celice (ESC) in primordialne spolne celice (PGC). Slednje migrirajo do mesta, kjer dozorijo in vstopijo v proces mejoze. Tako so osnova za nastanek jajčec in spermijev.

Ponovna aktivacija kromosoma X

V primeru razvoja ženskega osebka sesalcev poteče molekularni mehanizem, ki omogoča kompenzacijo doze izraženih genov, imenovan inaktivacija X kromosoma (XCI). Za celice ICM je značilno, da imajo aktivna oba X kromosoma. Torej če želijo celice z inaktivnim kromosomom preiti v stanje obeh aktivnih kromosomov in s tem zagotoviti normalen razvoj spolnih celic mora poteči mehanizem reaktivacije predhodno inaktiviranega X kromosoma. Prva inaktivacija poteče že v zgodnjem embrionalnem razvoju. Znanstveniki so dokazali, da pride do prve inaktivacije moškega X kromosoma pri miših že v času spermatogeneze. Vendar se inaktiviran kromosom ponovna aktivira na stopnji dveh celic – prva reaktivacija. Kasneje se očetov X kromosom ponovno inaktivira ter s tem zaključi postopno inaktivacijo X kromosoma v izven embrionalnih celicah. To inaktivacijo imenujemo vtisnjena inaktivacija. Za celice, ki se razvijejo v epiblast pa je potrebna druga stopnja reaktivacije očetovega X kromosoma. Tako se v nadaljnjem razvoju zagotovi pogojem za naključno inaktivacijo X kromosoma (ali očetovega ali materinega). Zadnja reaktivacija v razvoju celic poteče med potovanjem PGC do mesta zorenja. Ta aktivacija je nujno potrebna saj mora imeti celica, ki se bo razvila bodisi v semenčice ali jajčece aktivna oba kromosoma. Reakticacija genov na Xi torej spremlja nastanek pluripotentnih celic ženske blastociste in razvoj primordialnih spolnih celic. V stopnji blastociste se kromosom X aktivira v celicah, ki bodo tvorile epiblast, ob nastopu gastrulacije pa se inaktivira bodisi očetov ali materin kromosom X.

Reaktivacija X kromosoma je tesno povezana z reprogramiranjem celic. Ta na podlagi epigenetskih sprememb povzroči spremembo tipa celic. Poznamo naravno in umetno reprogramiranje. Naravno reprogramiranje poteče med gametogenezo, stopnja razvoja pri kateri pride do izbrisa epigenetskih modifikacij, ki bi jih lahko osebek podedoval od obeh. Primer umetnega reprogramiranja je kloniranje. Veliko poskusov oziroma raziskav mehanizma reaktivacije X kromosoma je bilo izvedenih in vitro, kar je tudi omogočalo vzdrževanje pluripotentnega okolja. Slednje je bilo omogočeno z dodajanjem in odvzemanjem specifičnih transkripcijskih faktorjev. V primeru epigenetsko stabilnega genoma somatskih celic ne pride do reaktivacije X kromosoma. Kar ima ključno vlogo pri pravilnem razvoju somatskih celic. Te morajo obdržati morajo starševske vtisnjene gene.Do reprogramiranja pa mora priti med razvojem spolnih celic. Po pristanku PGCs na mestu zorenja, pride do povečanja metilacij vtisnjenih genov kar pomeni izbris epigenetskih oznak. Torej se morajo za določitev spola vzpostaviti nove epigenetske označbe. Pri novem osebku se epigenetske oznake pojavijo šele po določitvi spola – tako vsak embrio prevzame ali materine ali očetove vtisnjene gene.

Mehanizem reaktivacije

Tesno povezavo med X kromosomom in reprogramiranjem matičnih celic predstavljajo pluripotentni faktorji. Ti delujejo na nekodirajoče gene X inaktivirajočega centra (Xic). Xist deluje, tako da se ovije okoli Xi kromosoma ter tako onemogoči izražanje genov. Na Xist obdanem s polikombno skupino proteinov poteče metilacija histona H3 (H3K27me3). Njegoveo izražanje uravnavajo tri nekodirajoče RNA (repA, Jpxin Tsix). Drugi pomemben dejavnik in hkrati skupni element aktivacije in inaktivacije je Rnf12 – ubikvitinska ligaza. Gen zanj se nahaja blizu lokusa za Xist. Protein se veže se na Xist ne pa tudi na Tsix promotor. Rnf12 je pod nadzorom pluripotentnih faktorjev Nanog, Oct4 in Sox2. Za raziskovanje pluripotenčnega stanja so bile uporabljene mišje embrionalne matične celice.Za katere je značilno majhno izražanje nekodirajoče Xist RNA ter odsotnost heterokromatinskih oznak na X kromosomu. Na stopnji epiblasta je moč iz mišjih in človeških embrijem pridobiti celične linije ter jih preoblikovati v embrionalne matične celice (ES). Torej pluripotentne celice, ki se lahko diferencirajo v tri spolne linije. ES celice so ponudile možnost raziskovanja epigenetskega reprogramiranja in XCI. Z možnostjo ustvarjanja induciranih pluripotentnih celic iz odraslih somatskih celic, pa se je ponudila priložnost za raziskovanje povezav med reprogramacijo in XCR.

Reaktivacija X kromosoma pri miših Za mišje ES celice je značilno povečano reprogramiranja starševskih epigenetskih oznak. Kot posledico zmanjšanega izražanja Xist sta v celicah prisotna dva aktivna kromososma. Tsix RNA – glavni regulator Xist - ja, spreminjanja kromatin Tsix promotorja. Tsix povzroči de novo metilacijo CpG otočkov ter utiša izražanje Tist promotorja. Izražanje Tsix regulira Xite. Nekodirajoča RNA X kromosoma, ki deluje kot ojačevalec transkripcije med diferenciacijo mES celic. Pluripotentni faktor Oct4 (vloga pri štetju ter parjenju kromosomov) se veže direktno na lokus Tsix in Xite. direktna vezava je značilna tudi za Sox2. Ta ustvari zanko med Xist in Xite domenama. Pri nediferenciiranih mES celicah prihaja do bialelne zastopanosti omenjenih pluripotentnih faktorjev. Takšno stanje pa je moč povezati s povečanim izražanjem Tsix RNA ter posledično utišanim izražanjem Xist ter aktivnim X kromosomom. Pluripotentni faktor Nanog deluje, tako da se poveže s pluripotentnim faktorjem Oct4 ali pa se direktno veže na Xist ter s tem inhibira njegovo izražanje. Poskusi na področju delovanja Nanog faktorja so pokazala, da njegova odsotnost ne vliva na raven izražanja Tsix. . Znanstveniki so zaključili, da Nanog deluje neodvisno od Tsix. miPS so celice ustvarjene iz somatskih celic in sicer ob pomoči povečanega izražanja transkripcijskih faktorjev Oct4, Sox2, Klf4, in c-Myc. Zanimive so ugotovitve da se je pri pretvorbi ženskih somatskih celic v miPS celice pojavilo intenzivno reprogramiranje X kromosoma. Pri tem pride do popolnega utišanja izražanja Xist in bialelnega izražanja Tsix ter izražanja Xite. Pri reaktiviranem kromosomu pride do izgube H3K27me3 ter povečanega izražanja polikombne skupine proteinov. Te spremembe povzročijo, da postane kromatin dostopnejši za traskripcijo. Če omenjene celice podvržemo diferenciacijskim pogojem se prično te obnašati enako kot mES celice. Torej poteče XCI. Povzetek rezultatov tako nakazuje na tesno povezavo med stanjem X kromosoma in pluripotentnostjo matičnih celic. Mišje pluripotentne matične celice so izvorno izolirane iz epiblasta (mEpiSCs). Epigenetsko stanje mEpiSCs se razlikuje od stanje embrionalnih matičnih celic (mES). Epiblastne celice so predvsem zaradi pluripotentnih signalnih poti, celične morfologije in genskega izražanja mnogo bolj podobne človeških ES celicam.

Reaktivacija X kromosoma pri človeku hES lahko razdelimo na tri razrede. Celice z zalo majhnim izražanjem XIST v nediferenciranm stanju in njegovim povečanjem med diferenciacijo, uvrščamo v razred I. Za celice razreda II je značilno, da imajo v obeh stanjih (diferenciranem in nediferenciranem) enako intenzivno izražen monoalelni XIST. Za razred III se predvideva samo delna inaktivacij X kromosoma. Že sama razdelitev celic v tri tipe in možnost prehajanja tipov I in II v tip III nakazujejo na zapleten mehanizem reprogramiranja človeških celic in s tem povezane reaktivacije inaktivnega X kromosoma. Mnogo raziskav nakazuje na mehanizem podoben mišjim celicam vendar ob prisotnosti dodatnih faktorjev.

Viri:

1. Hysolli E., Wook Jung Y., Tanaka Y., Kim K. in Park I. The lesser known story of X-chromosome reactivation. Cell Cycle, 2012, vol. 11, str. 229 -233.

2. Ohhata T. in Wutz A. Reactivation of the inactive X chromosome in development and reprogramming. Cellular and Molecular Life Sciences, 2013, vol. 70, str. 2443 – 2461.

3. Soo J., Woo H., Marcos J., Hans R. in Tae J. Reactivation of inactive X chromosome and posttranscriptional reprogramming of Xist in induced pluripotent stem cells. Journal of Cell Science, 2014, vol. str. 1 – 19.

4. Kim D., Jeon Y ., Anguera M., in Lee J. T. X-chromosome epigenetic reprogramming in pluripotent stem cells via noncoding genes. Elsevier, 2011, vol. 22, str. 336 – 342.

5. Cynthia R. Wagner, Ph.D. Germ Cells and Epigenetics. Nature Education, 2010, vol 3 (9), str.64.