Aptasense

Projekt Aptasense je delo iGEM ekipe iz švicarske univerze EPFL, 2017. (Povzela Petra Vivod)

Namen projekta je bil izboljšati diagnostične teste, ki temeljijo na zaznavanju proteinov v krvi ali serumu. Tega so se lotili s pomočjo aptamerov in RNA stikal, ki delujejo po principu »toehold«.

Aptamer

Aptameri so enoverižne DNA ali RNA molekule, ki se vežejo na tarčne molekule z visoko specifičnostjo in visoko afiniteto. DNA apatamere lahko enostavno izberemo iz knjižnice kandidatov z metodo SELEX. Cilj ekipe je bil pripraviti aptamera iz enoverižne DNA, ki bi se specifično vezala na tarčni protein. Prvi aptamer so na 3' koncu označili z biotinom in s tem dosegli, da se je močno vezal na podlago iz streptavidina, na 5' koncu pa se je specifično vezal na tarčni protein. Drugi apatamer se je s 3' koncem specifično vezal na tarčni protein na 5' koncu pa je bil podaljšan s tarčno sekvenco za »toehold stikalo«.

»Toehold stikalo«

»Toehold stikalo« je RNA fragment, ki ima zapis za reporterski protein. Fragment ima sekundarno strukturo v obliki lasnične zanke, ki zakriva vezavno mesto za ribosom in s tem onemogoča translacijo reporterskega proteina. »Toehold stikalo« je dizajnirano na način, da cilja tarčno RNA. Ko je tarčna RNA prisotna, se komplementarno veže na toehold stikalo. Vezava odpre lasničo strukturo, s tem se izpostavi vezavno mesto za ribosom, temu pa sledi začetek translacije reporterskega proteina.

Ekspresijski sistem

Za translacijo reporterskega proteina je potreben ustrezen ekspresijski sistem. Odločili so se za pripravo lizata, brezceličnega ekspresijskega sistema. Za pripravo lizata je potrebno pripraviti kulturo na rastnem mediju LB in jo inkubirati preko noči. Nato je potrebno celice centrifugirati, sprati in sonificirati. Sonifikacija je metoda s katero s pomočjo ultrazvoka porušimo membrane. V nadaljevanju so pelet, v katerem so proteini, ločiti od supernatanta in ekstrahirali lizat.

Ekipa si je kot reporterski gen izbrala gen za α podenoto β-galaktozidaze, diagnostični test pa so izdelali po principu α-komplementacije. S tem so dobili hiter in občutljiv kvalitativen signal. β-galaktozidaza je tetramer, sestavljen iz dveh različnih podenot α in Ω, ki sta kodirani z genoma lacZα in lacZΩ. Protein je funkcionalen le, če so podenote združene. Ker je celoten gen za β-galaktozidazo velik, bi bilo izražanje celotnega proteina dolgotrajnejše. Zato so se odločili, da bodo kot reporterski gen uporabili le α podenoto tega proteina. Uporabili so lizat seva E. Coli M15-T7, ki ima delecijo ostankov 11-41 v α podenoti, Ω podenota pa je še vedno funkcionalna. Ta sev torej ne producira funkcionalne β-galaktozidaze. Encim bo posledično substrat pretvoril v obarvani produkt le, če se bo v sistemu izrazil reporterski gen. Z namenom izboljšati hitrost prepisovanja so izbrali sev, ki ima dodan gen za RNA polimerazo bakteriofaga T7. T7 RNA polimeraza je hitra, specifična in natančna polimeraz in se veže na promotor T7.

Z namenom optimizacije diagnostičnega testa, so najprej optimizirali ekspresijski sistem. Za določanje učinkovitosti izražanja genov v lizatu so si pomagali s kvantitativnim testom – spremljali so fluorescenco EGFP. Lizat vsebuje precej eksonukleaz, ki razgrajujejo DNA. GamS protein bakteriofaga λ ščiti linearno DNA pred razgradnjo z eksonukleazami, kar posledično poveča izražanje proteinov. Uporabili so mešanico lizatov dveh bakterijskih sevov. Poleg seva M15-T7, so uporabili še sev Top10-gamS, ki so ga pripravili sami. Oblikovali so biokocko BBa_K2203000 [1], ki vključuje kodirajoče zaporedje za GamS protein in jo vključili v plazmid, s katerim so transformirali bakterijski sev Top-10. Ta sev ima tako kot sev M15-T7 napako v α podenoti gena za β-galaktozidazo.

Če so želeli spremljati izražanje genov v brezceličnem ekspresijskem sistemu, so morali lizatu naknadno dodati aminokisline, nukleotide, tRNA, CoA, NAD, cAMP, soli, pufre ter DNA, ki zapisuje gen za reporterski protein EGFP. Primerjali so izražanje EGFP proteina v primeru, ko so uporabili samo lizat seva M15-T7 ter v primerih, ko so uporabili mešanico lizatov sevov M15-T7 in Top10-GamS v različnih razmerjih. najboljši rezultat so dobili pri mešanici lizatov v razmerju 1:1 oziroma 1:2. Pri razmerju 1:3 in 1:4 je bilo izražanje manjše, verjetno zaradi pomanjkanja T7 polimeraze. Nato pa so preverili še, ali je ta ekspresijski sistem primeren tudi za izražanje gena lacZα v testu α-komplementacije. Za ta namen so oblikovali novo biokocko BBa_K2203002 [2], v katero so vključili kodirajoče zaporedje gena lacZα z dodanim promotorjem T7. V lizat so dodali substrat CPRG, polisaharid rumene barve, ki ga β-galaktozidaza pretvori v vijolični produkt. Lizat, ki so mu dodali DNA kodirajoče zaporedje gena T7-lacZα se je obarval vijolično, v nasprotnem primeru pa je ostal obarvan rumeno.

Aptamer – »Toehold stikalo« – test α-komplementacije

Pri projektu so delali s »toehold stikalom« za detekcijo virusa Zika, ki zazna prisotnost specifičnega RNA zaporedja virusa Zika v vzorcu. Oblikovali so novo biokocko [3]. Konstrukt je vseboval T7 promotor, »toehold stikalo«, reporterski gen - gen z zapisom za α podenenoto β-galaktozidaze ter T7 terminator. Ker so »toehold stikala« RNA molekule, aptameri pa enoverižne DNA molekule, so morali preveriti, ali se molekuli komplementarno vežeta ena na drugo. Najprej so testirali delovanje »toehold stikala«. K lizatu seva M15 so dodali tarčno RNA – konstrukt sestavljen iz T7 promotorja, tarčne RNA sekvence in T7 terminatorja. Znotraj tarčne sekvence se nahaja 36 baz dolga sekvenca, komplementarna »toehold stikalu«. »Toehold stikalo« se je vezalo na tarčno RNA in gen za β-galaktozidazo se je začel izražati. Po eni uri je lizat je spremenil barvo iz rumene v vijolično. Nato so preverili še, ali »toehold stikalo« deluje tudi ob prisotnosti enoverižne DNA tarčne sekvence. Tudi v tem primeru se je raztopina obarvala vijolično, brez komplementarne enoverižne DNA pa je ostala rumena. Testirali so tudi mejo detekcije, to je minimalno koncentracijo dodane enoverižne DNA, potrebne za spremembo barve in določili. Določili so, da je le ta 500 nM.

Za testiranje delovanja povezave aptamer – »toehold stikalo« so uporabili aptamera, ki se specifično vežeta na trombocitni rastni faktor (PDGF). PDGF ima ključno vlogo pri pljučnih boleznih ter angiogenezi v razvoju raka, zato bi ga lahko uporabili v diagnostične namene. Prvi aptamer je bil označen z biotinsko značko, drugi aptamer pa je bil na 5' koncu podaljšan s 27B tarčno sekvenco virusa Zika. Nato so pripravili nosilec, kamor so vezali primarni aptamer. Odločili so se za uporabo magnetnih kroglic, ki so jih prekrili s streptavidinom. Streptavidin ima visoko afiniteto do biotina z disociacijsko konstanto okoli 10^-15 M. Vezava streptavidin - biotin je ena izmed najmočnejših nekovalentnih reakcij v naravi. Magnetne kroglice je možno iz lizata odstraniti z magnetom ter jih nato enostavno spirati in resuspendirati v različnih raztopinah. Na ta način se različne molekule vežejo ena vrh druge na povrini kroglic. V projektu so se poslužili »sendvič testa«. Na kroglice iz streptavidina so najprej vezali aptamer označen z biotinom, nato so nanj vezali tarčni protein, za njim pa še sekundarni aptamer s tarčno sekvenco za »toehold stikalo«. Kroglice so nato resuspendirali v lizatu, ki je vseboval »toehold stikalo« za detekcijo virusa Zika z reporterski genom za α podenoto β-galaktozidaze. Po petih urah inkubacije, so kroglice ločili od lizata in pomerili absorbanco pri 595 nm in 37 ºC. Vzorec, ki je vseboval »toehold stikalo«, vezano na drugi aptamer, je imel višjo absorbanco v primerjavi z negativno kontrolo.

Toehold designer

Ekipa je pripravila tudi svojo programsko opremo Toehold designer za oblikovanje »toehold stikal«. Oblikovali so »toehold stikalo«, ki je ciljalo RNA virusa Hepatitisa C (HCV). Program išče najbolj optimalno sekvenco, ki ob zvitju v sekundarno strukturo upošteva, da mora biti tarčna molekula čim bolj dostopna za »toehold stikalo«, hkrati pa mora biti »toehold stikalo« čim bolj dostopno za vezavo na tarčno molekulo. Za tem, ko je program Toehold designer obdelal tarčno sekvenco, jim je kot rezultat podal najboljše ujemanje tarčna sekvenca/»toehold stikalo«. Najboljše »toehold stikalo«, ki ga je generiral program so testirali in vitro. Oblikovali so biokocko BBa_K2203003 [4], ki vsebuje »toehold stikalo« za testiranje HCV ter gen za α podenoto β-galaktozidaze, ki so jo vstavili v plazmid pSB1C3. Plazmid so namnožili, izrezali toehold stikalo ter ga skupaj s substratom za β-galaktozidazo in tarčno sekvenco prenesli v ustrezen lizat. Po določenem času so opazili spremembo barve.

Ekipi je uspelo izpolniti cilj. Izboljšali so diagnostični test, saj so pokazali, da bi v prihodnosti lahko proteine diagnosticirali na podlagi aptamerov in se s tem izognili dolgotrajni pripravi specifičnih protiteles za izvedbo testa ELISA.