SynORI – ogrodje za večplazmidne sisteme

Povzeto po projektu SynORI (Vilna - Litva) iz tekmovanja iGEM 2017.

Avtorica: Mojca Hunski

Raziskovalci se v genskem inženirstvu pri delu s plazmidi velikokrat srečajo s težavami, kot so nizko število kopij plazmida v celici ter nezmožnost sočasnega obstoja dveh ali več plazmidov v isti celici v odsotnosti selekcijskega pritiska (nekompatibilnost skupin plazmidov). Rešitev so v svojem projektu, poimenovanem SynORI, tj. sintetični ORI (mesto začetka replikacije), na tekmovanju iGEM 2017 predstavili študentje iz Vilne. Ustvarili so ogrodje, ki raziskovalcem omogoča lasten nadzor nad številom kopij določenega plazmida ter izbiro števila skupin plazmidov v celici, ki bodo med sabo kompatibilne.<ref>http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania (21. 1. 2018)</ref>

Lasten nadzor nad številom kopij plazmida

Plazmidi običajno dajejo gostiteljski celici marsikatero uporabno lastnost ali funkcijo (npr. odpornost na antibiotike in dodatne presnovne poti), lahko pa predstavljajo za celico tudi veliko breme, če je njihovo število kopij previsoko. Prav tako je pomembno, da se med delitvijo celic ne izgubijo, zato je nujno potrebno uravnavanje podvojevanja plazmidov.<ref>G. del Solar, M. Espinosa. "Plasmid copy number control: an ever-growing story." Molecular Microbiology 2000, 37 (3), 492-500.</ref> Različni plazmidi imajo različne načine regulacije podvojevanja ter so lahko v celici v visokem ali nizkem številu kopij. Študentje zmagovalne ekipe so se osredotočili na naravni plazmid E. coli ColE1, katerega uravnavanje podvojevanja poteka preko nastanka kompleksa med dvema komplementarnima kratkima molekulama RNA (RNA I in RNA II).

ColE1

Podvojevanje plazmida ColE1 se prične s prepisovanjem gena za RNA II, katerega konstitutivni promotor se nahaja 555 bp navzgor od mesta ORI. RNA II se zvije v kompleksno sekundarno strukturo, sestavljeno iz več zgradb steblo-zanka, kar omogoči tvorbo stabilnega kompleksa z matrično DNA na mestu ORI. Encim RNazaH nato napade novonastali hibrid in cepi molekulo RNA II na 3'-koncu, da se izpostavi hidroksilna skupina, da lahko tako RNA II služi kot začetni oligonukleotid za DNA-polimerazo I pri sintezi vodilne verige.

Uravnavanje števila kopij plazmida poteka s kratko nekodirajočo RNA I, ki inhibira RNA II. Transkripcija gena za RNA I se prične 445 bp navzgor od mesta ORI in poteka v nasprotni smeri, kot poteka transkripcija gena za RNA II, tako da je RNA I v celoti komplementarna 5'-koncu RNA II in se lahko veže nanjo. S tem se spremeni sekundarna struktura RNA II, ki posledično ne more več tvoriti stabilnega kompleksa z DNA na mestu ORI in je tudi RNazaH ne more cepiti. Inhibicija je dodatno ojačana še s proteinom Rop, ki se veže na začetni kompleks RNA I-RNA II in ga stabilizira. Višje, kot je število kopij plazmida, večja je koncentracija RNA I v celici in tako je podvojevanje ustavljeno. <ref>T. Itoh, J. Tomizawa.(1980) "Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H." Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77, 2450–2454.</ref> <ref>J. Tomizawa et al. "Inhibition of ColE1 RNA primer formation by a plasmid-specified small RNA." Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78, 1421–1425.</ref>

Modeliranje in eksperiment

Cilj ekipe je bil pripraviti ogrodje, s katerim bi lahko vsak raziskovalec enostavno spreminjal oziroma reguliral število kopij plazmida po lastnih potrebah. To so storili tako, da so najprej popolnoma dezaktivirali promotor za RNA I, zapis za RNA I pa potem skupaj z izbranim promotorjem vstavili poleg gena za RNA II.

Promotor za RNA I (pRNAI) je komplementaren ravno tistemu delu zapisa za RNA II, ki je ključen za tvorbo sekundarnih struktur, pomembnih pri nastanku kompleksa z DNA in posledično pri začetku podvojevanja. S spreminjanjem nukleotidnega zaporedja pRNAI se tako spreminja tudi sekundarna zgradba RNA II, zato so študentje s podatki iz literature in z računalniškimi analizami izbrali 5 takšnih mutiranih zaporedij za pRNAI, ki ne bi povzročila večjih sprememb v sekundarni strukturi RNA II in bi hkrati imela najnižjo afiniteto za RNA-polimerazo. Za določitev, katero izmed mutiranih zaporedij najbolje ustreza pogojem, so najprej celice transformirali z nemutiranim (wt) plazmidom oziroma s plazmidom z mutiranim pRNAI ter po inkubaciji določili število kopij plazmida (PCN) na celico s kvantitativnim PCR. Mutirane plazmide so izolirali in v njih vstavili še wt zapis za RNAI skupaj z wt pRNAI. Po transformaciji in inkubaciji so ponovno določili PCN. Za nadaljnje delo so izbrali tisto mutirano zaporedje, kjer je bila razlika med PCN celic z wt plazmidom in celic z mutiranim pRNAI največja, razlika med PCN celicah z wt plazmidom ter celic z mutiranim pRNAI in nemutiranim genom pa najmanjša. To zaporedje so poimenovali kar RNA II in pripravili tudi biokocko (BBa_K2259000).

Nato so preverili, ali lahko s spreminjanjem moči promotorja za RNA I vplivajo na PCN. Poleg novega konstrukta RNA II so vstavili gen za RNA I pod kontrolo različnih Andersonovih konstitutivnih promotorjev. Z eksperimenti so potrdili hipotezo, da močnejši promotor v primerjavi z nemutiranim pRNA I povzroči zmanjšanje, šibkejši pa povečanje PCN. Podoben eksperiment so naredili z uporabo inducibilnega ramnoznega promotorja (BBa_K914003), le da so v tem primeru spreminjali koncentracijo ramnoze v gojišču. Hipotezo, da se z večanjem koncentracije ramnoze v gojišču PCN znižuje, so potrdili, kljub temu pa izbira ramnoznega promotorja ni bila najboljša, saj so že nizke koncentracije ramnoze v gojišču povzročile zmanjšanje PCN na le nekaj kopij, prav tako pa je prišlo do velikega zmanjšanja PCN tudi v gojišču brez ramnoze. Študentje so z ekperimenti tako dokazali, da lahko z njihovo napravo SynORI ter z izbiro ustreznega promotorja sami nadzorujemo in po želji izberemo število kopij plazmida v celici.

(Ne)kompatibilnostne skupine plazmidov

V celici je lahko hkrati več kot 1 tip plazmida, ki morajo biti med sabo kompatibilni. Če pa vnos dodatnega plazmida v celice, ki že vsebujejo nek plazmid, povzroči destabilizacijo predhodno prisotnega plazmida, sta plazmida nekompatibilna. Običajno je vzrok za nekompatibilnost enak mehanizem kontrole replikacije med različnimi tipi plazmidov, kar lahko povzroči izgubo enega plazmida (predvsem tistega z nizkim številom kopij) skozi več generacij.

Eksperiment

Študentje so si za naslednji cilj pri projektu zadali pripravo različnih kompatibilnih tipov plazmidov, ki bi sicer imeli enak mehanizem kontrole podvojevanja, ampak bi bil vsak tip specifičen zase. Znano je, da so za inhibicijo podvojevanja plazmida ColE1 najbolj pomembne medsebojne interakcije molekul RNA I in RNA II le med tremi zankami. S spreminjanjem zaporedij zank RNA I in RNA II, ki bi bila specifična za določen tip, bi ustvarili nove različne tipe plazmidov, ki pa bi bili med sabo kompatibilni, saj ne bi prišlo do tvorbe kompleksov med molekulami RNA različnih plazmidov. Zaradi predhodne dezaktivacije pRNAI ter vstavljanja gena za RNA I na drugo mesto ni nujno potrebno, da sta molekuli RNA popolnoma komplementarni med sabo.

Iz podatkov iz literature <ref>W. W. Grabow et al. "Self-assembling RNA nanorings based on RNAI/II inverse kissing complexes." Nano Lett 2011,11(2), 878–87.</ref> so pridobili različne kombinacije zaporedij zank RNA I in RNA II, ki lahko med sabo tvorijo komplekse. Izbrali so 5 različnih zaporedij RNA II (5 skupin), ki so imela mutirana zaporedja le za prvi dve zanki. Z mutiranjem tretje zanke bi namreč lahko povzročili motnje v začetku replikacije, saj je sekundarna struktura RNA II zelo občutljiva na mutacije v tem delu. Za RNA I pa so izbrali 10 različnih zaporedij (5 skupin s po dvema zaporedjema, ki sta se razlikovala samo v zapisu za tretjo zanko).

Najprej so preverili, kako samo sprememba zaporedja RNA II vpliva na PCN, in izločili iz eksperimenta tista zaporedja, ki so povzročila veliko zmanjšanje PCN, saj je to pomenilo, da je prišlo do spremembe sekundarne strukture RNA II in posledično ta ni mogla služiti kot začetnik replikacije. Nato so v te plazmide vstavili še ustrezna zaporedja za RNA I (na enem plazmidu zapisa za RNA I in II iz iste skupine) ter preverili, ali je prišlo do inhibicije podvojevanja (cis-delovanje).

Nato so zaporedja za RNA II ter zaporedja za RNA I ločeno vstavili v dva različna plazmida (RNA II v BBa_K2259081 ter RNA I v pSB4A5) ter transformirali celice s kombinacijami dveh različnih plazmidov. S tem so želeli ugotoviti, ali in pri katerih kombinacijah skupin je prišlo do zmanjšanja PCN (trans-delovanje). Le-te skupine so med sabo nekompatibilne. Pri projektu so uspešno pridobili dve kombinaciji skupin, ki pa sta bili med sabo kompatibilni. Nato so že s predhodno pripravljenimi plazmidi, ki so vsebovali zapisa za RNA I in RNA II iz ene skupine, transformirali celice skupaj z domnevno kompatibilnimi plazmidi z zapisom iz druge skupine ter določili PCN. Ker ni prišlo do zmanjšanja PCN pri nobeni skupini, so tako še enkrat potrdili, da je eksperiment uspel in da gre res za kompatibilni skupini.

Zaključek

Litovski študentje so v celoti uspešno izpeljali projekt SynORI, za katerega so prejeli tudi veliko nagrado v skupini projektov dodiplomskih študentov. Pripravili so novo standardizirano ogrodje za večplazmidne sisteme, ki raziskovalcem omogoča veliko svobode pri uravnavanju podvojevanja plazmidov. Dodatno pa to ogrodje vključuje še možnost uporabe selekcijskega sistema, s katerim lahko z uporabo le enega antibiotika preverimo uspešnost transformacije celice z do 5 plazmidi, ter poseben sistem delitve celic, ki zagotavlja, da se plazmidi z nizkim številom kopij med delitvijo ne izgubijo.

Viri

<references />