Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov

Biološka zdravila so na svetovnem trgu farmacije ena izmed najbolj rastočih smeri, vendar jih ovira visoka cena proizvodnje v primerjavi z običajnimi kemijskimi zdravili. To bi lahko rešili z izboljšavo transgenskih tehnik za proizvajanje takšnih zdravil. Kokošji bioreaktorji so redko uporabljeni, predvsem zaradi težke priprave transgenskih živali v preteklosti. Z novejšimi metodami izražamo terapevtski protein v jajčnem beljaku, kar močno zniža ceno proizvodnje <ref name="prvi"> referenca ena </ref>.

Priprava bioloških zdravil

Razvoj postopka za pripravo rekombinantnega človeškega inzulina je usmeril farmacevtsko industrijo v razvoj več bioloških zdravil oz. proteinov. To so lahko protitelesa, encimi, citokini, rastni faktorji… Ta zdravila se v največjem obsegu pripravlja v bakterijah, kvasovkah, redkeje sesalskih celicah. Vsak sistem se definira s kompleksnostjo procesa, količino produkta, ustreznostjo PTM in najpomembneje, s ceno. V namen znižanja slednje, se razvijajo novi genetsko spremenjeni sistemi, ki temeljijo na živini. Pripravili so transgenske ovce, koze ter krave na takšen način, da se je terapevtski protein izločal v mleku. Kljub izjemni inovativnosti te metode, so prisotne tudi pomanjkljivosti – majhno število potomcev, dolga obdobja brejosti, zahteva po velikih življenjskih površinah in količinah hrane, težka izolacija terapevtika iz mleka (visoka vsebnost maščob) ter njegova reabsorpcija (negativne posledice za žival)<ref name="prvi"/>.

Kokošji bioreaktor bi terapevtik izločal v jajčni beljak. Ta vsebuje približno 3,5 g beljakovin v jajčnem beljaku v 60 g jajcu, vsaka kokoš pa znese letno preko 300 jajc. Cena gojenja je nizka, namnožitev transgenskih kokoši pa sorazmerno enostavna in hitra. Tudi glikozilacijski vzorec je podoben človeku, kar pomeni nizko imunogenost ter visoko biološko aktivnost terapevtika. Način priprave transgenskih kokoši so izvedli s pomočjo lentivirusov, izražanje pa omejili na jajcevod (torej le v jajčni beljak) s pomočjo zaporedij iz gena za ovalbumin. Fuzija s Fc proteinom je povečala razpolovni čas ter zvišala biološko aktivnost, prav tako omogoča izolacijo preko afinitetne kromatografije <ref name="prvi"/>.

Metode in rezultati

Priprava čistega in biološko aktivnega interferona α2a

Interferon α2a je citokin, ki se uporablja pri zdravljenju hepatitisa in nekaterih oblik raka. 500 bp dolg zapis je bil vstavljen v lentivirusni vektor, osnovan na EIAV (virus infektivne anemije konjev), ki se ni bil sposoben podvajati. 900 bp dolgo zaporedje ovalbuminskega promotorskega zaporedja med odzivnim elementom za estrogen in od steroidov odvisnim regulatornim elementom (EREOVA2) je povečalo izražanje in ga tudi omejilo na jajcevod (v jajčni beljak) <ref name="prvi"/>. Pripravljen vektor so injicirali v embrije iz izleženih jajc, da so pripravili G0 transgenske kokoši. G₀ petelin, izležen iz teh jajc je moral prestati PCR analizo za preverjanje vstavljanja gena – DNA je bila pridobljena iz semenske tekočine. Nato so ga križali z wild type kokošmi. G₁ potomcem so izolirali DNA iz krvi ter jo analizirali z restrikcijo in prenosom po Southernu <ref name="prvi"> referenca dva </ref>. Prisotnost interferona α2a v jajčnem beljaku so preverjali v jajcih kokoši G₁ in G₂ z western blotom, ter določili koncentracijo s komercialno dostopnim kitom za ELISO. Biološko aktivnost so preverili s celicami, ki so imele odzivni element občutljiv na inteferon, kateri je povzročil prepis luciferaze. Čiščenje produkta je bilo sestavljeno iz pH redukcije in centrifugiranja ter Hi Trap BLUE kolone. Po čiščenju so dobili 15 mg citokina na 100 mL jajčnega beljaka, kar je 60 % manj kot so določili z ELISO, zagotovili pa so ≥95 % čistost (kromatografija z obrnjeno fazo, SEC-MALS). Protivirusna aktivnost je bila preverjena proti H1N1 virusu gripe A v A549 celicah. Interferon α2a iz beljaka je bil bolj učinkovit kot komercialno dostopen (iz E. Coli)<ref name="prvi"/>.

Priprava čistega in biološko aktivnega fuzijskega prašičjega rastnega faktorja s Fc

CSF1 (»colony stimulating factor«) ima ključne vloge pri diferenciaciji, proliferaciji in funkciji makrofagov, uporablja se tudi v regenerativni medicini. Prisoten je pri večini sesalskih vrst, fuzija s Fc proteinom pa poveča razpolovni čas ter njegovo učinkovitost in vivo. Zapis za fuzijski protein pCSF1-Fc je bil kloniran v pLenti6 lentivirusni vektor izpeljan iz virusa HIV. Pred njim je bil promotor EREOVA2, za njim pa optimiziran posttranskripcijski regulatorni element oPRE iz svizca (»woodchuck«). Postopek priprave transgenskih kokoši je bil enak kot pri prej opisani pripravi interferona. Funkcionalnost proteina so preverili s Ba/F3 celicami, ki so imele izražen receptor za CSF1. Za njihovo preživetje je bila nujna prisotnost CSF1. Tudi tukaj so z enakimi metodami kot pri interferonu uspeli zagotoviti ≥97 % čistost proteina. Pokazali so tudi, da se iz jajčnega beljaka da izolirati protein tudi, če je zamrznjen do -80 °C za obdobje 1 meseca. Njegovo biološko aktivnost so pokazali na miših, tretiranih z izoliranim pCSF1-Fc. Analizirali so jetra, vranico in kri. V primerjavi s kontrolo so se povišale F4/80⁺ CD11b⁺ v krvi in F4/80⁺ makrofagi v jetrih, kar pomeni, da izolirani protein res deluje <ref name="prvi"/>.

Zaključek

V tej študiji so pokazali, da so lentivirusni vektorji učinkovita metoda priprave transgenskih kokoši s stabilnim prenosom genske spremembe na potomce, izražanje pa je omejeno le na jajcevod oz. jajčni beljak.. Težavo jim je predstavljala prenizka stopnja izražanja za komercialno uporabo metode ter tudi izolacija iz beljaka, ki sestoji iz veliko različnih beljakovin (izgube). Cena kokošjih bioreaktorjev bi lahko dosegla dvakrat nižjo ceno kot z običajnimi sesalskimi celicami, v največji meri zaradi nižjih stroškov vzdrževanja poslopja za kokoši ter odsotnosti potrebe po »dobri proizvodni praksi« dokler ne razbijemo jajca. Vsekakor pa je potrebne še veliko optimizacije ter testiranja aplikacije na ta način pripravljenih terapevtikov na ljudeh, kjer ovir zagotovo ne bo manjkalo. <references/>