Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z in vivo sintezo v E. coli.

Zdravljenje duševnih motenj

Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. 2016, 3(7), 619–627. </ref>.

Psilocibin

Psilocibin je psihedelična spojina, ki se sintetizira iz triptofana in je produkt v različnih gobah iz rodu Psilocybe. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. 2017, 56(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. 2019, 25(4), 897–903.</ref> .

Magi.Coli

V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v E. coli, da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, katerih produkte najdemo v biosintetski potiPsilocybe cubensis. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH so vključili v drug plazmid, da bi ga sočasno izrazili. Pridobljen sistem Magi.Coli so želeli izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v E. coli z optimizacijo kodonov, zlasti PsiH. Optimizacijo kodonov so želeli preizkusiti na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive Neurospora crassa.

Priprava na eksperimente

Geni psi

Zaporedja za vse psi gene divjega tipa so pregledali, da ne bi vsebovali neželenih restrikcijskih mest. Poleg teh mest so odstranili tudi kriptične promotorje in RBS mesta znotraj gena.

Konstrukti VVD

Vsi kontrukti VVD so temeljili na izvornem proteinu VVD iz Neurospora crassa. VVD36 kodirajoče zaporedje je bilo ustvarjeno z odstranitvijo prvih 36 aminokislinskih ostankov in dodajanjem začetnega kodona. Cisteinski ostanek na položaju 73 (TGC) so spremenili v alanin s spremembo kodona v GCC, s tem se je VVD spremenil v fluoroprotein. Nastal je VVD36-C73A (BBa_K3140005).

Izbor plazmidov

Plazmid pCW

Protein PsiH je citokrom P450 monooksigenaza. Zapisi za encim PsiH so znani po tem, da so zelo zahtevni za funkcionalno izražanje v E. coli in pogosto zahtevajo posebne pogoje izražanja ali šaperone. Potrebujejo partnerski encim P450 reduktazo iz Psilocybe cubensis, vendar P450 reduktaza ni dobro opisana in tudi ni bila izražena v E. coli. Plazmid pCW je pogosto uporabljen plazmid, ki vsebuje človeški gen P450 in gen za citokrom P450 reduktazo. Upali so, da bo ta sistem optimiziran tako, da bodo izrezali obstoječi človeški P450 in ga nadomestili s citokrom P450 monooksigenazo. To bi omogočilo izražanje proteinov PsiH skupaj z obstoječim genom za P450 reduktazo.

Plazmid pET-28c

Plazmid pET-28c je strogo reguliran plazmid, namenjen močnemu in nadzorovanemu izražanju vseh treh psi genov. Na N-konec genov so vstavili polihistidinsko oznako (6x His-tag), ki jim je omogočila čiščenje proteinov z Ni-afinitetno kromatografijo.

Plazmid pUS250

Plazmid pUS250 je primeren za vstavljanje vseh treh genov psiK, psiD in psiM v en plazmid s pomočjo Golden Gate molekulskega kloniranja.

Izvedba eksperimentov

Izražanje genov psiK, psiD in psiM

Prvi uspešen korak je bil kloniranje genov psiK (BBa_K3140002), psiD (BBa_K3140000) in psiM (BBa_K31440003) v plazmidu pET-28c. Z ustreznimi restriktazami so rezali plazmide pET-28c, da so vstavili posamezne gene in ligirali. Celice E. coli BL21[DE3] so transformirali s plazmidi. Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da poleg plazmida pET-28c v celice vstavijo še dodaten plazmid pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo Ni-afinitetne kromatografije. Funkcionalnost proteinov so preverili s pomočjo kvalitativnega testa tekočinske kromatografije in masne spektrometrije (LCMS). Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

Sestavljanje genskega skupka ("gene cluster")

Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Celice E.coli DH5α so transformirali s plazmidom pUS250 in pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Celice so centrifugirali in očistili supernatant. Produkte so identificirali s pomočjo LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze baeocistina, intermediata v sintezni poti proteina PsiM. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje kodonov proizvedenih proteinov.

Izražanje in karakterizacija PsiH encima

V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 (BBa_K3140001), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 (BBa_K3140004), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v E.coli so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice E.coli za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v E. coli. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

Nastanek dvoplazmidnega sistema

S tem, ko so vstavili dva plazmida v isto celico, je bila ustvarjena celotna biosintetska pot psilocibina v E. coli. Transformirali so celice E. coli DH5α s pGro7, s pUS382 in s pUS387. To so imenovali Magi.Coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo. Proizvodnjo proteinov iz pUS382 so inducirali z IPTG in iz pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo.

Gojenje

Namen tega dela je bil raziskati in primerjati pogoje rasti celic v fermentorju in v laboratorijski kulturi. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za gojenje v fermentorju.

Optimizacija

Optimizacija kodonov

Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona (BBa_K3140006, BBa_K3140007,BBa_K3140008, BBa_K3140009). Rezultate optimizacije bi uporabili za optimizacijo kodonov genov psi in prišli do izboljšanega izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodonov morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

PCR nagnjen k napakam

S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescirajočega proteina VVD. Rezultati določanja zaporedja genov VVD iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Mutacija določenega mesta v kodonu za metioninski ostanek 130 je povzročila spremembo v izolevcin, treonin ali levcin, ter izboljšala fluorescenco proteina (BBa_K31440010).

Zaključek

Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v in vivo pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v E.coli so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

Viri

<references/>