MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP

Projekt MARS je bil delo nemške ekipe iz Aachna pod vodstvom Julie Gehrmann, študentke računalništva in Marcela Wittmunda, študenta biotehnologije. Cilj je bil razvoj bioreaktorja, ki je sposoben reciklirati ATP. Nagrajeni so bili z zlato medaljo, med vsemi podiplomskimi programi pa so zasedli drugo najboljše mesto.

Spletna stran: https://2020.igem.org/Team:Aachen

Avtor povzetka: David Miškić

Bioreaktor

Bioreaktorji so naprave, v katerih se vzpostavi in kontrolira okolje za potek kemijskega procesa, ki ga izvajajo živi organizmi. Reakcijska mešanica je konstantno mešana, po potrebi pa lahko dovajamo zrak, hranila in reagente ter odvajamo odvečno kulturo ali produkte. V bioreaktorju so organizmi lahko prosto plavajoči ali imobilizirani na podlagi, reakcija pa šaržna, kjer po poteku vsakič znova sestavimo mešanico ali kontinuirana, kjer konstantno odvajamo izrabljeno mešanico. Proces ni omejen le na uporabo celotnih mikroorganizmov, možno je tudi izvajanje le z encimi in ostalimi produkti [1].

Problem ATP in ideja

Adenozin trifosfat (ATP) je nukleotid, sestavljen iz adenina, riboze in treh fosfatov. Je pomemben kofaktor pri encimskih reakcijah, saj je kot najbolj pogost energent vpleten pri večini metabolnih poti, prav tako pa ima lahko stranske vloge pri regulaciji in post translacijskih modifikacijah [2]. Pri industrijskih postopkih se ne regenerira, ker je celična respiracija preveč kompleksen proces, da bi ga lahko posnemali izven organizmov, zato se mora dodajati in proizvajati s pomočjo kemijske sinteze prek polifosfatov ali pa z genetsko modificiranimi organizmi, za katere je potrebno imeti ločeno opremo in velika mera prečiščevanja [3]. Ekipa si je za cilj zadala razvoj bioreaktorja, ki je sposoben ciklične produkcije ATP s pomočjo sončne svetlobe. Tako ni potrebno naknadno dodajati ATP, ta pa se tudi dokončno ne porablja. Niso izbrali dela na celotnih živih celicah, ampak na kemijski šasiji. Tako so se izognili možnosti stranskih reakcij. Začeli so z obstoječim postopkom regeneracije, ki temelji na liposomih z bakteriorodopsinom in ATP sintazo, dodali pa so magnetno imobilizacijo delcev in namesto liposomov uporabili polimersome. Magnetna imobilizacija omogoča ponovno uporabo ter tako dodatno prispeva k nižanju cene postopka.

Komponente

Bakteriorodopsin izvira iz Halobacterium salinarum, ATP sintaza pa iz Saccharomyces cerevisiae. Bakteriorodopsin je membranski protein arhej, ki vsebuje eno molekulo retinala, bližnja asparaginska kislina pa je vir protonov za njegovo protonacijo. V prisotnosti svetlobe retinal spremeni konformacijo in proton odda v zunajcelični prostor. Najbolj učinkovito se absorbira zelena svetloba v rangu 500-650 nm z maksimumom pri 568 nm [4]. ATP sintaza uporabi protonski gradient kot vir energije za pretvorbo ADP v ATP. Prav tako je membranski protein, ki uporabi energijo dveh protonov za formacijo ene fosfodiesterske vezi [6].
Polimersom je izgrajen iz mešanice PETOz (poli(2-etil-2-oksazolin)) in PDMS (polidimetilsiloksan) polimerov, okoli 100-500 nm v premeru. So bolj stabilni od liposomov [7]. Magnetne kroglice iz polistirena so vezane na več polimersomov, velike so okoli 3,7 um.
Za vezavo poskrbi proteinski kompleks iz sidrnega proteina za liposome in polistirenskega vezavnega proteina. Posebnost pristopa je tudi, da so encimi v primerjavi z biološkimi obrnjeni, saj se protoni črpajo v notranjost polimersomov, ATP pa je tako generiran v okolju.
Ob tem si je ekipa zadala narediti še 2 dodatne strojne komponente, ki bi proces naredile bolj avtomatiziran, prav tako pa te komponente pomagajo pri celostni izvedbi procesa. Zasnovali so stresalnik iz poceni splošno dostopnih komponent kot je 12V motor in pogonski pas iz 3D tiskalnika, ki se prilega Erlenmajericam ter mehansko roko za pomikanje cevk iz flašk med izvedbo reakcije, saj sicer povzročijo prevelike strižne sile. Za roko so nadgradili obstoječi pristop iz 2017. Dodatno so izdelali IOT platformo za skupno kontrolo vse opreme, vendar pa niso uspeli realizirati vsega v danem času, predvsem zaradi okrnjenega dostopa do ustrezne opreme zaradi pandemije.

Razvoj

Računalniško modeliranje

Postopek razvoja je bil podprt predvsem s pomočjo računalniškega modela, ki je ekipi pomagal nadaljevati kljub omejenemu dostopu do laboratorijev. Ustvarili so matematični model v okolju MatLab s pomočjo SimBiology, ki jim je pomagal kvantificirati sposobnosti sistema za recikliranje ATP ter predvideti najbolj optimalne vrednosti parametrov poskusa, s čemer so lahko zasnovali laboratorijske eksperimente. Odkrili so, da je koncentracija encima logaritmično povezana z hitrostjo nastanka produkta ter da je premer šasije eksponentno povezan z ravnotežnostno koncentracijo ATP in posledično hitrostjo nastanka produkta. To pomeni da je bolje izbrati čim večji premer šasije, ki ga še omogočajo strižne sile bioreaktorja. Ob tem so določili da je edini najbolj pomemben pokazatelj reakcije ravnotežnostna koncentracija ATP, ki je uporabna za kvantifikacijo učinkovitosti celotne implementacije. Poslužili so se tudi raznih orodij za simulacijo molekularne dinamike, predvsem GROMACS in Chimera. Namen tega dela je bila gradnja iz »bottom up« smeri, predvsem pri zasnovi membranskega sidranja in oblikovanja komponent na način, kjer je bilo prisotnih čim manj konfliktov.

Eksperimentalno delo

Za izbiro pravih vezavnih peptidov je ekipa uporabila GFP, ki je služil kot oznaka za peptide, pri čemer so bili pozorni na fluorescenco, ki je ostala po več korakih izpiranja. Ta postopek je bil uporabljen za testiranje vezave na polistirenske kroglice in liposomske domene. Pri testih na liposomih je bilo potrebno izbrati zelo nežno tehniko ločevanja, da se ne porušijo, ekipa se je odločila za dializo. Prav tako je bila specifičnost kritična, saj vezavni peptid ni smel vezati dveh istovrstnih komponent, ampak le liposom na magnetni delec. Peptid MBP-1 je bil izbran za vezavo na polistirenske magnetne delce, LCI pa za vezavo na liposome [5]. Za pripravo liposomov so uporabili rehidracijo posušenega lipidnega filma, kar je ustvarilo unilamelarne vezikle. Odločili so se za pozitivno nabite liposome, da bi se lahko bakteriorodopsin bolje integriral. Končna sestava je bila 80% POPC (fosfatidilholin) in 20% DOTAP (dioleoil-3-metilamonij propan). Za pridobitev večjih, ki bi bili bolj vidni pod mikroskopom, so dodali mešanico olja in surfaktanta v vodni raztopini. Z mešanjem in tresenjem se oblikujejo veliki vezikli, dodatek fluorescentno označenih lipidnih molekul pa dodatno služi za potrditev oblike. Bakteriorodopsin so pridobili iz kulture Halobacterium salinarium, ki je za čim višjo sintezo bila gojena z manj kisika. Za ATP sintazo je bila izbrana Saccharomyces cerevisiae zaradi lažje izolacije mitohondrijev [8]. Za končno izolacijo so uporabili inhibitor IF1 z dodanih His-Tag, ki se veže na ATP sintazo, ki jo tako lahko ločimo z afinitetno kromatografijo. Pridobljene proteine so vstavili v membrano veziklov prek destabilizacije s pomočjo detergenta Triton-X 100 in mešanice bakteriorodopsina in ATP sintaze. Po inkubaciji se detergent odstrani. Za testiranje pravilnega delovanja bakteriorodopsina so uporabili pH indikator piranin, ki je potrdil če se notranjost vezikla res zakisa. Za karakterizacijo aktivnosti regeneracije ATP je bila izbrana karboksilatna reduktaza iz bakterije Nocardia otitidiscaviarum, ki pretvori 3-hidroksibenzojsko kislino v 3-hidroksibenzaldehid, potrebuje pa ATP in NADPH kot kofaktorje. Pripravljene vezikle ekipa primerja z negativno kontrolo, prav tako pa s regeneracijo prek celičnega pristopa z bakterijo Escherichia coli in regeneracijo prek polifosfatov, za ugotovitev učinkovitosti novega pristopa. Izkazalo se je da pristop s celicami proizvede manj končnega produkta kot pristop s polifosfati, saj se produkt preveč reducira in dobimo alkohol, ob tem pa kofaktorje porabi za svoj metabolizem, tako pa niso v celoti na voljo za reakcijo. MARS je ob tem imel dodatno prednost da ni bil občutljiv na citotoksične koncentracije reagentov.

Rezultati

Za svoje postopke so izdelali in objavili protokole, odkrili so vezavni peptid za magnetne delce in testirali številne peptide za vezavo na liposome. Reaktor, ki so ga zasnovali je skoraj v celoti lahko natisnjen na 3D tiskalniku. Potrdili so da koncept deluje in reaktor je konkurenčen obstoječim postopkom.

Objavili so 5 novih biokock za ATP sintazo in povezovalni kompleks:

• BBa_K3456000 I1-60GFPHis - ATPase Inhibitor with GFP and His-Tag

992 baznih parov dolga inhibitorna sekvenca, ki se veže na ATPazo in inhibira hidrolitsko funkcijo, ne pa sintezne. Sekvenca izvira iz govejega inhibitornega proteina IF1, dodana pa sta ji eGFP in His-Tag. Del služi za izolacijo ATPaze z afinitetno kromatografijo. Konstrukt nadzira Lac operon.

• BBa_K3456001 I1-60 - ATPase Inhibitor

183 baznih parov, ki sestavlja prvih 60 aminokislin govejega proteina IF1, služi kot eden od gradnikov inhibitorja ATPaze.

• BBa_K3456002 MBP-1

105 baznih parov dolg antimikrobni peptid ki izvira iz koruze (Zea Mays). Sposoben je vezave na polistirenske površine.

• BBa_K3456003 Domain Z

174 baznih parov dolg rigidni ločevalni polipetid, s katerim povežemo protein za vezavo na liposome in protein za vezavo na polistirenske kroglice.

• BBa_K3456004 MBP-1 - LCI fusion protein

423 baznih parov dolg končni vezavni kompleks in proteina za vezavo na polistirenske kroglice, spacerja in proteina za vezavo na liposome sestavljene iz 16:0-18:1 PC:POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfoholin).

Objavili so kodo za Arduino in seznam delov za stresalnik, nepopolno kodo in seznam delov za mehansko roko in backend kodo za IOT platformo.

Zaključek

MARS je edinstven projekt v smislu regeneracije ATP. Ta je potreben v raznih encimskih reakcijah v ekonomsko pomembnih področjih industrije, kot je farmacija z karboksilatnimi reduktazami za proizvodnjo zdravil in prehrambena industrija za proizvodnjo aromatičnih aldehidov kot je vanilin [10]. Potrebujemo ga tudi pri raziskovanju njegove vloge na razne receptorje kot je rP2X2 [11]. Reaktor je dobra alternativa dragemu dodajanju kemijskega ATP, katerega cene se za nekaj gramov gibljejo v stotinah evrov [9]. Zaradi vseh težav z razvojem in dostopom do ustrezne opreme se je po projektu ekipa odločila vzpostaviti tudi BioAccelerator v domači univerzi v Aachnu. To je prostor z laboratoriji, ki je na voljo študentom, ki želijo izvesti svoje raziskave brez omejujočih rokov tekmovanj kot je iGEM. Uspešno so organizirali svoj prvi hackaton z iGEM ekipo iz Maastrichta s področja hitrih testov za COVID19.

Viri

• [1] IUPAC, Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the "Gold Book") (1997). Online corrected version: (2006–) "bioreactor". doi:10.1351/goldbook.B00662
• [2] Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Stryer, L. (2014). Biochemie, Kapitel 15 – Der Stoffwechsel: Konzepte und Grundmuster.
• [3] Sakai, Y., Rogi, T., Yonehara, T. et al. High–Level ATP Production by a Genetically–Engineered Candida Yeast. Nat Biotechnol 12, 291–293 (1994). https://doi.org/10.1038/nbt0394-291
• [4] Becher, B. M. & Cassim, S. Y. (1975). Improved Isolation Procedures for the Purple Membrane of Halobacterium Halobium. Preparative Biochemistry, 5:2, 161-178, DOI: 10.1080/00327487508061568
• [5] One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cell, Kerstin Göpfrich, Barbara Haller, Oskar Staufer, Yannik Dreher, Ulrike Mersdorf, Ilia Platzman, and Joachim P. Spatz, ACS Synthetic Biology 2019 8 (5), 937-947 DOI: 10.1021/acssynbio.9b00034
• [6] Junge W, Nelson N (June 2015). "ATP synthase". Annual Review of Biochemistry. 84: 631–57. doi:10.1146/annurev-biochem-060614-034124. PMID 25839341.
• [7] Xu K, Liu X, Bu L, Zhang H, Zhu C, Li Y. Stimuli-Responsive Micelles with Detachable Poly(2-ethyl-2-oxazoline) Shell Based on Amphiphilic Polyurethane for Improved Intracellular Delivery of Doxorubicin. Polymers. 2020; 12(11):2642. https://doi.org/10.3390/polym12112642
• [8] Choi, C. S. (2019). Die mitochondriale Unfolded Protein Response in Saccharomyces cerevisiae.
• [9] ATP | SigmaAldrich. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=ATP&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=SI&focus=product (accessed 13.4.2021).
• [10] France, S.P., Hepworth, L.J., Turner, N.J., Flitsch, S.L., 2017. Constructing biocatalyticcascades: in vitro and in vivo approaches to de novo multi-enzyme pathways. ACSCatal. 7, 710–724.https://doi.org/10.1021/acscatal.6b02979.
• [11] Eva-Verena Bongartz, Jürgen Rettinger & Ralf Hausmann: Aminoglycoside block of P2X2 receptors heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes; Purinergic Signalling (2010) 6:393–403 DOI 10.1007/s11302-010-9204-9