Odkritje encima 'dicer': Difference between revisions
| (2 intermediate revisions by the same user not shown) | |||
| Line 5: | Line 5: | ||
SiRNA so dolge od 21-25 nukleotidov, medtem ko sta na 3' koncu dva prosta nukleotida. SiRNA se po delovanju Dicerja vežejo v multikompleks RISC (RNA-induced silencing complex), kjer se RNA cepi do enoverižne vodilne RNA. Kompleks RISC lahko z vodilno RNA prepozna določeno mesto na mRNA in jo cepi. Dolžina siRNA je pri protozojih za 4 nt daljša kot pri večceličarjih. Dicer je na površini nabit naključno - ponekod pozitivno drugje negativno in nevtralno, na površini kanala, kjer se veže negativno nabita dsRNA, pa je pretežno pozitivno nabit. Deluje tako, da se DsRNA vsidra v kanal, ki je med bazo in glavo, in sega od domene PAZ (prosti konec) do domene Rnaze-III, kjer jo tudi prereže. Ti domeni sta oddaljeni za 65A, kar je sorazmerno s številom odrezanih nukleotidov. Vezava dsRNA ni specifična glede na določeno zaporedje, saj ima Dicer večjo afiniteto do neponavljajočih se zaporedij. Veže se na konec dsRNA, cepi v predelu noge in zapusti dsRNA vključno z siRNA, ki jo prenese do kompleksa RISC. Eno dsRNA cepi več Dicerjev in kot po vrsti se novi Dicer veže na novi prosti konec takoj, ko nastane. | SiRNA so dolge od 21-25 nukleotidov, medtem ko sta na 3' koncu dva prosta nukleotida. SiRNA se po delovanju Dicerja vežejo v multikompleks RISC (RNA-induced silencing complex), kjer se RNA cepi do enoverižne vodilne RNA. Kompleks RISC lahko z vodilno RNA prepozna določeno mesto na mRNA in jo cepi. Dolžina siRNA je pri protozojih za 4 nt daljša kot pri večceličarjih. Dicer je na površini nabit naključno - ponekod pozitivno drugje negativno in nevtralno, na površini kanala, kjer se veže negativno nabita dsRNA, pa je pretežno pozitivno nabit. Deluje tako, da se DsRNA vsidra v kanal, ki je med bazo in glavo, in sega od domene PAZ (prosti konec) do domene Rnaze-III, kjer jo tudi prereže. Ti domeni sta oddaljeni za 65A, kar je sorazmerno s številom odrezanih nukleotidov. Vezava dsRNA ni specifična glede na določeno zaporedje, saj ima Dicer večjo afiniteto do neponavljajočih se zaporedij. Veže se na konec dsRNA, cepi v predelu noge in zapusti dsRNA vključno z siRNA, ki jo prenese do kompleksa RISC. Eno dsRNA cepi več Dicerjev in kot po vrsti se novi Dicer veže na novi prosti konec takoj, ko nastane. | ||
Na delovanje Dicera v celicah vplivajo proteini dsRBP (dsRNA binding proteins) in predstavljajo kofaktorje RNA vezavnih domen. Prvi odkriti je bil pri C. Elegans RDE-4 dimerni protein, ki ima visoko afiniteto le do dolge dsRNA zunanjega izvora. V vinski mušici so zaznali protein R2D2, njegova funkcija v Dicer-2/R2D2 kompleksu pa je prenos siRNA do kompleksa RISC. Pri sesalcih so odkrili dva proteina, TRBP, ki verjetno deluje podobno kot R2D2, in PACT. | Na delovanje Dicera v celicah vplivajo proteini dsRBP (dsRNA binding proteins) in predstavljajo kofaktorje RNA vezavnih domen. Prvi odkriti je bil pri C. Elegans RDE-4 dimerni protein, ki ima visoko afiniteto le do dolge dsRNA zunanjega izvora. V vinski mušici so zaznali protein R2D2, njegova funkcija v Dicer-2/R2D2 kompleksu pa je prenos siRNA do kompleksa RISC. Pri sesalcih so odkrili dva proteina, TRBP, ki verjetno deluje podobno kot R2D2, in PACT. | ||
---- | |||
[http://www.youtube.com/watch?v=RdxtoTRkHSk] Animacija delovanja Dicerja | |||
== Struktura == | == Struktura == | ||
| Line 10: | Line 13: | ||
Trenutno razumevanje njegove strukture je še dokaj omejeno na preprostejše organizme, zgradba kompleksnejših pa je v večini primerjana s preprostejšimi ali posameznimi izoliranimi domenami, še vedno pa ostaja velika uganka, katero skušajo znanstveniki na vso moč razrešiti. V seminarju se bomo omejili na človeški Dicer, katerega gen se nahaja na 14 kromosomu. Encim vsebuje ligande za vezavo kovinskih, magnezijevih, manganovih ionov, nukleotidov in RNA. Najnovejša dognanja pridobljena na nivoju elektronske mikroskopije nakazujejo na sledečo asimetrično strukturo poenostavljeno ponazorjeno v obliki črke L. L oblikovani encim opredelimo na več regij, in sicer glavo, telo, bazo in roko encima. Encim je sestavljen iz večih poddomen, vsaka izmed njih pa ima svoj namen. Na sprednjem delu glave najdemo PAZ domeno, ki prepozna konce dvovijačne RNA. V telesu encima se nahajata Rnaza IIIa in Rnaza IIIb domeni . Predstavljata ključna vlogo encima, saj cepita dvovijačno RNA na manjše segmente, ki potem kot smo že omenili zgoraj vplivajo na utišanje genov. Med PAZ in Rnazno domeno je »platform domena«, vendar le-ta ne leži direktno med obema domenama, ampak ju fizično povezuje manjša »ruler domena«. PAZ domena in katalitična stran Rnazne III domene sta tako ločeni. Razdalja med obema domenama tudi pojasnjuje dolžino nastalih segmentov. Ena izmed domen je tudi N-terminalna helikaza, katero delimo na tri globularne domene: HEL1, HEL2i in HEL2, ki tvorijo strukturo podobno sponki. Prilegajo se Rnaznem III aktivnem mestu . Umeščamo jih znotraj roke, dokazi pa potrjujejo, da se raztezajo tudi čez celotno bazo encima. Jedro helikaze tvori C-oblikovan notranji kanal. O funkciji, ki jo opravljajo helikazne domene, se dolgo ni vedelo nič, sedaj pa je znano, da olajšujejo prepoznavanje pre-miRNA zank oziroma translokacijo dolge dvovijačne RNA. Za razliko od večine Dicerjev, človeški Dicer za svoje delovanje ne potrebuje ATP. | Trenutno razumevanje njegove strukture je še dokaj omejeno na preprostejše organizme, zgradba kompleksnejših pa je v večini primerjana s preprostejšimi ali posameznimi izoliranimi domenami, še vedno pa ostaja velika uganka, katero skušajo znanstveniki na vso moč razrešiti. V seminarju se bomo omejili na človeški Dicer, katerega gen se nahaja na 14 kromosomu. Encim vsebuje ligande za vezavo kovinskih, magnezijevih, manganovih ionov, nukleotidov in RNA. Najnovejša dognanja pridobljena na nivoju elektronske mikroskopije nakazujejo na sledečo asimetrično strukturo poenostavljeno ponazorjeno v obliki črke L. L oblikovani encim opredelimo na več regij, in sicer glavo, telo, bazo in roko encima. Encim je sestavljen iz večih poddomen, vsaka izmed njih pa ima svoj namen. Na sprednjem delu glave najdemo PAZ domeno, ki prepozna konce dvovijačne RNA. V telesu encima se nahajata Rnaza IIIa in Rnaza IIIb domeni . Predstavljata ključna vlogo encima, saj cepita dvovijačno RNA na manjše segmente, ki potem kot smo že omenili zgoraj vplivajo na utišanje genov. Med PAZ in Rnazno domeno je »platform domena«, vendar le-ta ne leži direktno med obema domenama, ampak ju fizično povezuje manjša »ruler domena«. PAZ domena in katalitična stran Rnazne III domene sta tako ločeni. Razdalja med obema domenama tudi pojasnjuje dolžino nastalih segmentov. Ena izmed domen je tudi N-terminalna helikaza, katero delimo na tri globularne domene: HEL1, HEL2i in HEL2, ki tvorijo strukturo podobno sponki. Prilegajo se Rnaznem III aktivnem mestu . Umeščamo jih znotraj roke, dokazi pa potrjujejo, da se raztezajo tudi čez celotno bazo encima. Jedro helikaze tvori C-oblikovan notranji kanal. O funkciji, ki jo opravljajo helikazne domene, se dolgo ni vedelo nič, sedaj pa je znano, da olajšujejo prepoznavanje pre-miRNA zank oziroma translokacijo dolge dvovijačne RNA. Za razliko od večine Dicerjev, človeški Dicer za svoje delovanje ne potrebuje ATP. | ||
Vemo, da je pre-mRNA še precej nedodelana oblika, kar bi po vsej logiki otežilo delovanje encima, kljub temu pa fleksibilnost encima omogoči, da ta prilagodi obliko substratu in na ta način dovoli, da od idealne RNA odstopajoča pre-mRNA deluje nemoteno kot nepopoln kompleks. | Vemo, da je pre-mRNA še precej nedodelana oblika, kar bi po vsej logiki otežilo delovanje encima, kljub temu pa fleksibilnost encima omogoči, da ta prilagodi obliko substratu in na ta način dovoli, da od idealne RNA odstopajoča pre-mRNA deluje nemoteno kot nepopoln kompleks. | ||
== Metode odkrivanja == | == Metode odkrivanja == | ||
Latest revision as of 20:57, 2 April 2012
Encim Dicer je endoribonukleaza iz družine Rnaz-III in je ključen v procesu utišanja genov. Odkrila in poimenovala ga je Emily Bernstein s sodelavci leta 2001. Njegova naloga je cepitev vezi dvojnovijačne RNA (dsRNA), ki je zunanjega izvora, v kratke interferenčne RNA (siRNA) in vezi pre-mikroRNA, ki nastane v jedru celice, v miRNA. Nahaja se v citosolu in je velik skoraj 250kDa. Praktično skoraj ni organizma, ki ne bi vseboval encima Dicer, saj ga najdemo takorekoč v preprostih protozojih kot tudi v kompleksnejših metazojih. Genom sesalcev kodira samo en Dicer protein, insekti (vinska mušica) in glive dva Dicerja, nekatere rastline pa kodirajo štiri Dicerju podobne proteine.
Delovanje
SiRNA so dolge od 21-25 nukleotidov, medtem ko sta na 3' koncu dva prosta nukleotida. SiRNA se po delovanju Dicerja vežejo v multikompleks RISC (RNA-induced silencing complex), kjer se RNA cepi do enoverižne vodilne RNA. Kompleks RISC lahko z vodilno RNA prepozna določeno mesto na mRNA in jo cepi. Dolžina siRNA je pri protozojih za 4 nt daljša kot pri večceličarjih. Dicer je na površini nabit naključno - ponekod pozitivno drugje negativno in nevtralno, na površini kanala, kjer se veže negativno nabita dsRNA, pa je pretežno pozitivno nabit. Deluje tako, da se DsRNA vsidra v kanal, ki je med bazo in glavo, in sega od domene PAZ (prosti konec) do domene Rnaze-III, kjer jo tudi prereže. Ti domeni sta oddaljeni za 65A, kar je sorazmerno s številom odrezanih nukleotidov. Vezava dsRNA ni specifična glede na določeno zaporedje, saj ima Dicer večjo afiniteto do neponavljajočih se zaporedij. Veže se na konec dsRNA, cepi v predelu noge in zapusti dsRNA vključno z siRNA, ki jo prenese do kompleksa RISC. Eno dsRNA cepi več Dicerjev in kot po vrsti se novi Dicer veže na novi prosti konec takoj, ko nastane. Na delovanje Dicera v celicah vplivajo proteini dsRBP (dsRNA binding proteins) in predstavljajo kofaktorje RNA vezavnih domen. Prvi odkriti je bil pri C. Elegans RDE-4 dimerni protein, ki ima visoko afiniteto le do dolge dsRNA zunanjega izvora. V vinski mušici so zaznali protein R2D2, njegova funkcija v Dicer-2/R2D2 kompleksu pa je prenos siRNA do kompleksa RISC. Pri sesalcih so odkrili dva proteina, TRBP, ki verjetno deluje podobno kot R2D2, in PACT.
[1] Animacija delovanja Dicerja
Struktura
Trenutno razumevanje njegove strukture je še dokaj omejeno na preprostejše organizme, zgradba kompleksnejših pa je v večini primerjana s preprostejšimi ali posameznimi izoliranimi domenami, še vedno pa ostaja velika uganka, katero skušajo znanstveniki na vso moč razrešiti. V seminarju se bomo omejili na človeški Dicer, katerega gen se nahaja na 14 kromosomu. Encim vsebuje ligande za vezavo kovinskih, magnezijevih, manganovih ionov, nukleotidov in RNA. Najnovejša dognanja pridobljena na nivoju elektronske mikroskopije nakazujejo na sledečo asimetrično strukturo poenostavljeno ponazorjeno v obliki črke L. L oblikovani encim opredelimo na več regij, in sicer glavo, telo, bazo in roko encima. Encim je sestavljen iz večih poddomen, vsaka izmed njih pa ima svoj namen. Na sprednjem delu glave najdemo PAZ domeno, ki prepozna konce dvovijačne RNA. V telesu encima se nahajata Rnaza IIIa in Rnaza IIIb domeni . Predstavljata ključna vlogo encima, saj cepita dvovijačno RNA na manjše segmente, ki potem kot smo že omenili zgoraj vplivajo na utišanje genov. Med PAZ in Rnazno domeno je »platform domena«, vendar le-ta ne leži direktno med obema domenama, ampak ju fizično povezuje manjša »ruler domena«. PAZ domena in katalitična stran Rnazne III domene sta tako ločeni. Razdalja med obema domenama tudi pojasnjuje dolžino nastalih segmentov. Ena izmed domen je tudi N-terminalna helikaza, katero delimo na tri globularne domene: HEL1, HEL2i in HEL2, ki tvorijo strukturo podobno sponki. Prilegajo se Rnaznem III aktivnem mestu . Umeščamo jih znotraj roke, dokazi pa potrjujejo, da se raztezajo tudi čez celotno bazo encima. Jedro helikaze tvori C-oblikovan notranji kanal. O funkciji, ki jo opravljajo helikazne domene, se dolgo ni vedelo nič, sedaj pa je znano, da olajšujejo prepoznavanje pre-miRNA zank oziroma translokacijo dolge dvovijačne RNA. Za razliko od večine Dicerjev, človeški Dicer za svoje delovanje ne potrebuje ATP. Vemo, da je pre-mRNA še precej nedodelana oblika, kar bi po vsej logiki otežilo delovanje encima, kljub temu pa fleksibilnost encima omogoči, da ta prilagodi obliko substratu in na ta način dovoli, da od idealne RNA odstopajoča pre-mRNA deluje nemoteno kot nepopoln kompleks.
Metode odkrivanja
Znanstveniki so odkrili, da je pri živalskih celicah prisotno samo post-transkripcijsko utišanje genov. Kompleks, ki pri tem sodeluje, deluje kot efektorska nukleaza in se imenuje RISC. Pri nadaljnjem raziskovanju le-tega so posledično naleteli na 20-25 nukleotidov dolgo zaporedje, ki služi kot začetno oz. uvodno zaporedje pri nizu reakcij utišanja genov. Po navadi gre za 22-nukleotidno RNA, ki je komplementarna mRNA substrata. Postavilo se jim je vprašanje, če je za nastanek 22-nukleotidne RNA zaslužen že znan RISC, ali gre za nov encim. Da bi raziskali dilemo, so izolirali RISC iz celic Drosophila S2. Celice S2 je celična linija mušice Drosophila melanogaster; iz primarne celične kulture izolirajo 20-24 ur stare celice zarodka. Nato so s centrifugiranjem pri 100,000g za eno uro ločili supernatant in usedlino (pelet). V usedlini so odkrili večji del kompleksa RISC, medtem ko se je v supernatantu pojavila 22-nukleotidna sekvenca. Tako so prišli do spoznanja, da je za cepitev 22-nukleotidne RNA iz mRNA odgovoren še neraziskan encim. Nov encim je imel podobno strukturo kot Drosha: vseboval je dva RNAzna III motiva in N-terminalno helikazno domeno, zato so ga uvrstili v družino RNAze III. Zaradi podobnosti z Drosho so njegovo funkcijo določevali primerjalno. Raziskave so najprej opravili in vitro, po začetnih obetavnih rezultatih pa tudi in vivo. Da bi preverili delovanje RNAznih III motivov, so označili Drosho in CG4792 (kasneje Dicer 1) s T7 epitopom. Encima sta bila izražena v transficiranih S2 celicah in izolirana s postopkom imunoprecipitacije, pri kateri so uporabili agarozo prepojeno s protitelesi. Metoda imunoprecipitacije je metoda obarjanja antigena proteina v raztopini s protitelesi, ki so specifična za nek antigen. Metoda je zelo primerna za ugotavljanje mest vezave proteinov na DNA ali RNA. Zopet se je pojavila 22 nukleotidov dolga sekvenca. Oborili so se antigeni za CG4792, rezultati za Drosho pa so bili negativni. Zaključili so, da lahko CG4792 cepi poljubno sekvenco mRNA in ustvari začetni korak pri utišanju genov – začetno sekvenco. Zaradi njegove funkcije rezanja mRNA so CG7492 poimenovali splošno Dicer (CG7492=Dicer 1). Prisotnost Dicer-ja je bila potrjena pri celicah zarodka vrste Drosophila melanogaster, pri Drosophila S2 celicah in tudi pri odraslih celicah mušice D. melanogaster. V nekatere poskuse so vključili tudi C. elegans, kjer je bilo prav tako ugotovljeno delovanje Dicer-ja. Pri poskusih so prišli do ugotovitve, da je za delovanje encima potreben ATP. Ob izčrpanju energije v obliki ATP, se je cepitev mRNA na 22-nukleotidno RNA močno upočasnila. Znanstveniki so se odločili preveriti, kako specifičen mora biti substrat, da ga Dicer cepi na krajše segmente. Za preiskovani organizem so vzeli C. elegans in D. melanogaster. Izkazalo se je, da Dicer cepi zgolj dvovijačno mRNA in da raje cepi daljša nukleotidna zaporedja. Sicer reže tudi krajša zaporedja, vendar odločilno vlogo igra dvojna vijačnica. Pri enovijačni mRNA z dolgim nukleotidnim zaporedjem je bil namreč Dicer neaktiven. Preiskovali so tudi delovanje encima in vivo. Ko so ustavili aktivnost Dicer-ja, se je utišanje genov močno zmanjšalo, vendar ne popolnoma. To nakazuje na možnost slabšega zatrtja delovanja Dicerja ali pa celo na prisotnost drugih mehanizmov, ki lahko utišajo gene.
Viri
1. Jaskiewicz L., Filipovicz W., Role of Dicer in Posttranscriptional RNA Silencing; Nature, 2008,
2. Voet & Voet: Biochemistry, 3. izdaja. Wiley, 2004,
3. Pick - Wei, L., et al. The molecular architecture of human Dicer. Nature structural & molecular biology. 2012, str. 1-6,
4. Bernstein E. et al.: Role for bidentate ribonuclease in the initiation step od RNA interference. Nature, 2001, št. 409, str. 363-366.
