ZFN nukleaze

VISOKO USPEŠNA USMERJENA MUTAGENEZA S POMOČJO NUKLEAZ CINKOVEGA PRSTA V METULJU MONARHU

UVOD

Metulj monarh je žuželka, ki vsako jesen migrira na jug. Pomoga si s sončnim kompasom v povezavi z biološko uro, kar mu omogoča ohranjanje smeri na poti. Pri tem igrata pomembno vlogo dva različna CRY proteina. Mehanizem molekularne ure temelji na avtoregulatorni kontroli na nivoju transkripcije preko povratne zanke. Transkripcijska faktorja CLK in CYC sprožita transkripcijo per, tim in cry2 genov. To privede do nastanka proteinov, ki v citoplazmi tvorijo komplekse ter krožijo nazaj v jedro, kjer CRY2 inhibira transkripcijo.

V naši študiji so se osredotočili na uvajanje mutacij v cry2 gen s pomočjo zinc-finger nukleaz (ZFN), ki ustvarjajo dedne poškodbe na DNA. ZFN so restrikcijske endonukleaze, ki lahko inducirajo mestno specifično prekinitev v obeh verigah DNA na želeni lokaciji v genomu. Prekinitve v obeh verigah DNA (DSB) se nato pri nizkih frakvencah popravljajo preko NHEJ poti, pri čemer pride do delecij in insercij v tarčnem mestu in posledično do spremembe bralnega okvirja. Induciranje DSB preko ZFN v kodirajočih zaporednjih proteinov, lahko povzroči nastanek nefunkcionalnih alelov.

METODE IN REZULTATI

Najprej so z računalniškim algoritmom cry2 gen skenirali za tarčne sekvence, ki bi se skladale z arhivom modulov cinkovega prsta. Našli so visoko kvalitetno mesto v eksonu 2, ki vsebuje 2 prepoznavni regiji ob vmesnem mestu, ki vsebuje endogeno restrikcijsko mesto. Sprememba bralnega okvirja v tej regiji povzroči nefunkcionalnost proteina. Za vsak prepoznavni element so skonstruirali ZFN z restrikcijsko domeno FokI. Konstrukt je nastal tako, da so sekvence, ki kodirajo štiri prste ZFN klonirali v ekspresijski vektor pCS2.

Celice DpN1 so transfecirali z različnimi dozami parov ZFN subkloniranih v ekspresijski vektor (pCS2) kompatibilen s celicami DpN1. Za določevanje uspešnosti transformacije so po amplifikaciji s PCR uporabili rezanje z restriktazo na mestu EagI, ki ga vsebuje divji tip gena. Tako dobimo pri divjem genu dva fragmenta. Po uvajanju mutacij preko mehanizma NHEJ restrikcijsko mesto EagI izgine in restriktaza ne more rezati, zato dobimo nerezan fragment. Učinkovitost ZFN za uvajanje mutacij je bila ocenjena na približno 12%. PCR fragmente, iz z ZNF transfeciranih celic, rezistentne na restrikcijo z EagI, so klonirali in sekvenirali.. Ugotovili so, da je v večini primerov prišlo do spremembe bralnega okvirja in posledično do skrajšanega proteina CRY2.

Za generiranje CRY2 knockouta so uporabili tehniko, s katero so mutirali prekurzorje zarodne linije. To so storili z injiciranjem dveh mRNA s 5' kapo, ki kodirata obe ZFN v oplojena jajčeca v fazi enega jedra. Injiciranje ZFN mRNA takoj po oploditvi pripomore k višji frekvenci mutacij v genomu, saj poteče mutacija zgodaj v razvoju osebka, v prekurzorskih celicah zarodne linije.

Ta tehnika je omogočila visokofrekvenčno usmerjeno mutagenezo tako v somatskih kot tudi v zarodnih celicah. Prisotnost mutacij so testirali z restrikcijsko analizo tkiva, ki ne vpliva na preživetje ali plodnost osebkov ter sekvenirali mutirane alele. Ličinke z visoko frekvenco mutacij v somatskih celicah so gojili naprej do stadija odrasle živali, da bi lahko preučili ali se lahko te mutacije prenašajo na potomce. Odrasle osebke so križali z divjimi in analizirali potomce. Mutirane ličinke so odkrili le med potomci dveh moških staršev in sicer s frekvencama 39,2% in 50%.

Za karakterizacijo narave ZFN-induciranih mutacij zarodne linije so klonirali in sekvenirali PCR fragmente, ki ustrezajo mutiranim alelom iz vsakega potomstva. V vsakem so našli po eno mutacijo. Ena mutacija je bila delecija 4 bp, druga pa insercija 2 bp, obe pa sta povzročili premik bralnega okvirja in posledično skrajšan protein CRY2, kar so potrdili tudi z izvedbo prenosa western.

Kot je bilo pričakovati pri knockout linijah biološka ura ni delovala pravilno medtem ko pri divjem tipu in pri heterozigotih ni bilo težav. Da bi ugotovili CRY2 vpliv na biološko uro so s kvantitativnim PCR v realnem času kvantificirali ekspresijo per in tim genov v knockout linijah. Ekspresija obeh je bila močno povečana, kar je dokaz, da CRY2 in vivo deluje kot transkripcijski represor za gene, ki vplivajo na biološko uro.

ZAKLJUČEK

Metoda usmerjene mutageneze z ZFN je zelo specifična in hkrati tudi zelo učinkovita, če jo izvedemo v pravem času. Injiciranje ZFN mRNA v fazi enega jedra, v mesto kjer se v tej fazi nahajajo prekurzorske celice zarodne linije, je vzrok za visoko učinkovitost mutageneze tako v somatskih kot tudi v zarodnih celicah. Tako se mutacije z visoko frekvenco prenašajo tudi v naslednje generacije potomcev.