Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne: Difference between revisions
No edit summary |
|||
| (One intermediate revision by the same user not shown) | |||
| Line 4: | Line 4: | ||
== IZBOR PRIMERNIH RF == | == IZBOR PRIMERNIH REKOMBINANTNIH RF == | ||
V raziskavi so se osredotočili na pripravo treh rekombinantnih človeških RF, ki dokazano sodelujejo pri procesu celjenja ran in pri celični proliferaciji. To so bili: epidermalni (huEGF), fibroblastni (huFGF2) in keratinocitni rastni faktor (huKGF1). | V raziskavi so se osredotočili na pripravo treh rekombinantnih človeških RF, ki dokazano sodelujejo pri procesu celjenja ran in pri celični proliferaciji. To so bili: epidermalni (huEGF), fibroblastni (huFGF2) in keratinocitni rastni faktor (huKGF1). | ||
Za vsak RF so pripravili različne genske konstrukte, nekateri so imeli na terminalnem delu zapis za signalno zaporedje KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) ali pa signalni peptid melitin. Vsi so vsebovali His-tag zaporedje in na 5' koncu Kozakovo zaporedje za členonožce (CAAATG), ki igra pomembno vlogo pri iniciaciji translacije. Pripravljena nukleotidna zaporedja so klonirali v homologna restrikcijska mesta pFastBac1™ vektorja. S tem so dobili donorske plazmide, ki so jih klonirali v celice ''E.coli'', v katerih sta že bila pomožni plazmid z zapisom za transpozazo in bakmid, bakulovirusni vektor. Opisani sistem imenujemo Bac-to-Bac® bakulovirusni sistem, v katerem pride do mestno-specifičnega prenosa genskega zapisa z donorskega plazmida na bakmid. Tako dobimo rekombinantne bakuloviruse. Nadalje so bakuloviruse pomnoževali v Sf21 insektnih celicah. Rekombinante bakuloviruse so injekcirali v ličinke insekta ''Trichoplusia ni''. Po 72 ur gojenja v rastnih komorah, so iz ekstraktov ličink pridobili proteine. | Za vsak RF so pripravili različne genske konstrukte, nekateri so imeli na terminalnem delu zapis za signalno zaporedje KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) ali pa signalni peptid melitin. Vsi so vsebovali His-tag zaporedje in na 5' koncu Kozakovo zaporedje za členonožce (CAAATG), ki igra pomembno vlogo pri iniciaciji translacije. Pripravljena nukleotidna zaporedja so klonirali v homologna restrikcijska mesta pFastBac1™ vektorja. S tem so dobili donorske plazmide, ki so jih klonirali v celice ''E.coli'', v katerih sta že bila pomožni plazmid z zapisom za transpozazo in bakmid, bakulovirusni vektor. Opisani sistem imenujemo Bac-to-Bac® bakulovirusni sistem, v katerem pride do mestno-specifičnega prenosa genskega zapisa z donorskega plazmida na bakmid. Tako dobimo rekombinantne bakuloviruse. Nadalje so bakuloviruse pomnoževali v Sf21 insektnih celicah. Rekombinante bakuloviruse so injekcirali v ličinke insekta ''Trichoplusia ni''. Po 72 ur gojenja v rastnih komorah, so iz ekstraktov ličink pridobili proteine. | ||
Glede na stopnjo topnosti proteinov in stopnjo smrtnosti okuženih ličink za vsak posamezen primer, so za nadaljevanje raziskave izbrali inokulacijsko dozo 5000 pfu/ ličinko in sicer z bakulovirusi bacMelEGFHis, bacFGF2His in bacKGF1HisKDEL. Izbrane 3 rekombinantne proteine so očistili in uporabili za testiranje funkcionalnosti. Ekspresijski izkupiček je bil 4.1 mg (za huEGF), 1.9 mg (za huFGF) in 0.5 mg (za huKGF) / g mase insekta. | Glede na stopnjo topnosti proteinov in stopnjo smrtnosti okuženih ličink za vsak posamezen primer, so za nadaljevanje raziskave izbrali inokulacijsko dozo 5000 pfu/ ličinko in sicer z bakulovirusi bacMelEGFHis, bacFGF2His in bacKGF1HisKDEL. Izbrane 3 rekombinantne proteine so očistili in uporabili za testiranje funkcionalnosti. Ekspresijski izkupiček je bil 4.1 mg (za huEGF), 1.9 mg (za huFGF) in 0.5 mg (za huKGF) / g mase insekta. | ||
Za nadaljno optimizacijo izkoristka produkcije človeških RF v ličinkah insektov so pripravili še različne konstrukte fuzirane z modificirano Fc regijo človeškega protitelesa IgG. Do povečanja izražanja fuzijskih proteinov v primerjavi z nefuzijskimi je prišlo samo v primerih konstruktov za človeški keratinocitni RF (huKGF1). Ekspresijsko najbolj produktiven je bil konstrukt bacMelKGF1Hinge-, dobili so kar 1.6 mg/g mase insekta. | Za nadaljno optimizacijo izkoristka produkcije človeških RF v ličinkah insektov so pripravili še različne konstrukte fuzirane z modificirano Fc regijo človeškega protitelesa IgG. Do povečanja izražanja fuzijskih proteinov v primerjavi z nefuzijskimi je prišlo samo v primerih konstruktov za človeški keratinocitni RF (huKGF1). Ekspresijsko najbolj produktiven je bil konstrukt bacMelKGF1Hinge-, dobili so kar 1.6 mg/g mase insekta. | ||
== BIOAKTIVNOST REKOMBINANTNIH RF == | |||
== BIOAKTIVNOST RF == | |||
Vsi trije rekombinanti RF so biološko aktivni, kar so dokazali s tremi testi. V prvem so preverjali njihovo sposobnost aktivacije ERK 1/2 poti (pride do fosforilacije). Tri vrste dermalnih celic so stimulirali z dodatkom očiščenih rekombinantnih RF. Celice so nato sprali, ekstrahirali njihove proteine in jih analizirali z NaDS-PAGE in naredili western prenos z uporabo anti-p-ERK 1/2 monoklonskimi protitelesi. RF so aktivirali fosforilacijo ERK 1/2. V drugem testu so celice stimulirali z naraščajočimi koncentracijami očiščenih RF. Določevanje celične proliferacije je potekalo z MTT metodo, ki je potrdila biološko aktivnost RF. V tretjem testu so preverjali uspešnost celjenja rane in vitro, dodani rekombinantni RF so aktivirali migracijo epitelijskih celic na mesto poškodbe in po 48 urah je bila dosežena skoraj popolna zacelitev rane. | Vsi trije rekombinanti RF so biološko aktivni, kar so dokazali s tremi testi. V prvem so preverjali njihovo sposobnost aktivacije ERK 1/2 poti (pride do fosforilacije). Tri vrste dermalnih celic so stimulirali z dodatkom očiščenih rekombinantnih RF. Celice so nato sprali, ekstrahirali njihove proteine in jih analizirali z NaDS-PAGE in naredili western prenos z uporabo anti-p-ERK 1/2 monoklonskimi protitelesi. RF so aktivirali fosforilacijo ERK 1/2. V drugem testu so celice stimulirali z naraščajočimi koncentracijami očiščenih RF. Določevanje celične proliferacije je potekalo z MTT metodo, ki je potrdila biološko aktivnost RF. V tretjem testu so preverjali uspešnost celjenja rane in vitro, dodani rekombinantni RF so aktivirali migracijo epitelijskih celic na mesto poškodbe in po 48 urah je bila dosežena skoraj popolna zacelitev rane. | ||
== ZAKLJUČEK == | == ZAKLJUČEK == | ||
Znanstvenikom je uspelo prikazati ekspresijo treh funkcionalno aktivnih človeških RF v ličinkah insekta ''T. ni'' v količinah, ki jih doslej z konvencionalnimi metodami še ni uspelo doseči. Dokazali so, da je predstavljena metoda uporabe bakulovirusnega vektorskega sistema in insektov kot žive biotovarne, lahko odličen alternativen ne-fermentacijski sistem za pridobivanje večjih količin človeških rastnih faktorjev, ki bi se lahko razširil na industrijsko proizvodnjo za namene regenerativne medicine ali kozmetike. Uporaba insektov namesto insektnih celičnih kultur omogoča poleg povečanje izkupička same ekspresije in krajšega razvojnega časa, stroškovno učinkovitejšo proizvodnjo proteinov brez uporabe tehnološko zahtevnih fermentacijskih postopkov. | Znanstvenikom je uspelo prikazati ekspresijo treh funkcionalno aktivnih človeških RF v ličinkah insekta ''T. ni'' v količinah, ki jih doslej z konvencionalnimi metodami še ni uspelo doseči. Dokazali so, da je predstavljena metoda uporabe bakulovirusnega vektorskega sistema in insektov kot žive biotovarne, lahko odličen alternativen ne-fermentacijski sistem za pridobivanje večjih količin človeških rastnih faktorjev, ki bi se lahko razširil na industrijsko proizvodnjo za namene regenerativne medicine ali kozmetike. Uporaba insektov namesto insektnih celičnih kultur omogoča poleg povečanje izkupička same ekspresije in krajšega razvojnega časa, stroškovno učinkovitejšo proizvodnjo proteinov brez uporabe tehnološko zahtevnih fermentacijskih postopkov. | ||
Latest revision as of 23:08, 24 March 2015
UVOD
Rastni faktorji (RF) so endogeni signalni peptidi, ki se specifično vežejo na receptorje na celični površini. So pomembni aktivni mediatorji pri celični rasti, proliferaciji, diferenciaciji in signaliziranju. Trenutne raziskave o celjenju ran so osredotočene na rastne faktorje, ki sodelujejo pri procesu celjenja ran, celični proliferaciji in migraciji. Pojavljajo se vprašanja zmanjševanja časa celjenja s vplivanjem na potek vnetja in možnostjo pospeševanja proliferativne faze.
IZBOR PRIMERNIH REKOMBINANTNIH RF
V raziskavi so se osredotočili na pripravo treh rekombinantnih človeških RF, ki dokazano sodelujejo pri procesu celjenja ran in pri celični proliferaciji. To so bili: epidermalni (huEGF), fibroblastni (huFGF2) in keratinocitni rastni faktor (huKGF1). Za vsak RF so pripravili različne genske konstrukte, nekateri so imeli na terminalnem delu zapis za signalno zaporedje KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) ali pa signalni peptid melitin. Vsi so vsebovali His-tag zaporedje in na 5' koncu Kozakovo zaporedje za členonožce (CAAATG), ki igra pomembno vlogo pri iniciaciji translacije. Pripravljena nukleotidna zaporedja so klonirali v homologna restrikcijska mesta pFastBac1™ vektorja. S tem so dobili donorske plazmide, ki so jih klonirali v celice E.coli, v katerih sta že bila pomožni plazmid z zapisom za transpozazo in bakmid, bakulovirusni vektor. Opisani sistem imenujemo Bac-to-Bac® bakulovirusni sistem, v katerem pride do mestno-specifičnega prenosa genskega zapisa z donorskega plazmida na bakmid. Tako dobimo rekombinantne bakuloviruse. Nadalje so bakuloviruse pomnoževali v Sf21 insektnih celicah. Rekombinante bakuloviruse so injekcirali v ličinke insekta Trichoplusia ni. Po 72 ur gojenja v rastnih komorah, so iz ekstraktov ličink pridobili proteine. Glede na stopnjo topnosti proteinov in stopnjo smrtnosti okuženih ličink za vsak posamezen primer, so za nadaljevanje raziskave izbrali inokulacijsko dozo 5000 pfu/ ličinko in sicer z bakulovirusi bacMelEGFHis, bacFGF2His in bacKGF1HisKDEL. Izbrane 3 rekombinantne proteine so očistili in uporabili za testiranje funkcionalnosti. Ekspresijski izkupiček je bil 4.1 mg (za huEGF), 1.9 mg (za huFGF) in 0.5 mg (za huKGF) / g mase insekta. Za nadaljno optimizacijo izkoristka produkcije človeških RF v ličinkah insektov so pripravili še različne konstrukte fuzirane z modificirano Fc regijo človeškega protitelesa IgG. Do povečanja izražanja fuzijskih proteinov v primerjavi z nefuzijskimi je prišlo samo v primerih konstruktov za človeški keratinocitni RF (huKGF1). Ekspresijsko najbolj produktiven je bil konstrukt bacMelKGF1Hinge-, dobili so kar 1.6 mg/g mase insekta.
BIOAKTIVNOST REKOMBINANTNIH RF
Vsi trije rekombinanti RF so biološko aktivni, kar so dokazali s tremi testi. V prvem so preverjali njihovo sposobnost aktivacije ERK 1/2 poti (pride do fosforilacije). Tri vrste dermalnih celic so stimulirali z dodatkom očiščenih rekombinantnih RF. Celice so nato sprali, ekstrahirali njihove proteine in jih analizirali z NaDS-PAGE in naredili western prenos z uporabo anti-p-ERK 1/2 monoklonskimi protitelesi. RF so aktivirali fosforilacijo ERK 1/2. V drugem testu so celice stimulirali z naraščajočimi koncentracijami očiščenih RF. Določevanje celične proliferacije je potekalo z MTT metodo, ki je potrdila biološko aktivnost RF. V tretjem testu so preverjali uspešnost celjenja rane in vitro, dodani rekombinantni RF so aktivirali migracijo epitelijskih celic na mesto poškodbe in po 48 urah je bila dosežena skoraj popolna zacelitev rane.
ZAKLJUČEK
Znanstvenikom je uspelo prikazati ekspresijo treh funkcionalno aktivnih človeških RF v ličinkah insekta T. ni v količinah, ki jih doslej z konvencionalnimi metodami še ni uspelo doseči. Dokazali so, da je predstavljena metoda uporabe bakulovirusnega vektorskega sistema in insektov kot žive biotovarne, lahko odličen alternativen ne-fermentacijski sistem za pridobivanje večjih količin človeških rastnih faktorjev, ki bi se lahko razširil na industrijsko proizvodnjo za namene regenerativne medicine ali kozmetike. Uporaba insektov namesto insektnih celičnih kultur omogoča poleg povečanje izkupička same ekspresije in krajšega razvojnega časa, stroškovno učinkovitejšo proizvodnjo proteinov brez uporabe tehnološko zahtevnih fermentacijskih postopkov.
