Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju

RJAVA GNILOBA

Rjava gniloba je ena najbolj destruktivnih bolezni breskev. Povzroča velike izgube pridelka, prizadene pa lahko tudi druge vrste sadja, kot so npr. nektarine, češnje, marelice in slive. Povzročitelja bolezni sta glivi Monilinia laxa in Monilinia fructicola. Vlažno podnebje, značilno za kraje, kjer omenjeno sadje pridelujejo, bolezen pospešuje, zato je škoda še toliko večja. Kljub temu, da so običajno okuženi plodovi, je možna tudi okužba cvetov in poganjkov. Če se okuženih delov rastline ne odstrani, le-ti tvorijo odlične pogoje za nadaljnje razmnoževanje povzročitelja in s tem dodatno širjenje bolezni. Bolezen se na sadju pojavi kot majhne rjave pike, ki se sčasoma večajo in zavzamejo celoten sadež. Na obolelih delih so pogosto vidni tudi skupki spor povzročitelja. Te se lahko med rastlinami prenašajo preko vetra, vode ali žuželk. Ljudje se bolezen trudijo nadzirati na več načinov. Pomembno je predvsem odstranjevanje in uničevanje okuženih delov rastlin in poškodovanih sadežev ter preventivna uporaba raznih fungicidnih sprejev. Poleg tega pa je nujna preprečitev poškodb sadja s pazljivim obiranjem in onemogočanje dotikanja med sadeži tekom zorenja. Sama zrelost sadja namreč prav tako pospešuje razvoj bolezni.

RAZISKAVA

Ker rjava gniloba povzroča probleme pridelovalcem sadja in se posledično uporablja veliko fungicidov, ki niso dobri za zdravje ljudi, znanstveniki raziskujejo druge možnosti nadzora te bolezni. Tako so odkrili kvasovko Metschnikowia fructicola, ki je naravni antagonist povzročitelja te in še številnih drugih bolezni sadja in zelenjave. Njen mehanizem delovanja je zaenkrat še neznan, obstaja pa več teorij delovanja:

• Tekmovanje za hranila.

• Zavzem niše.

• Spodbujanje gostiteljevih obrambnih mehanizmov.

• Izražanje hidrolaz (hitinaze, proteaze, glukanaze).

V obravnavanem članku so se raziskovalci posvetili raziskovanju zadnje lastnosti – torej izražanju hidrolaz oz. natančneje izražanju hitinaze. Najprej so pri kvasovki M. fructicola seva AP47 določili optimalno gojišče, raven izražanja hitinaze, celotno zaporedje in karakteristike njenega gena ter z uporabo koloidnega hitina kot substrata kolorimetrično preverili tudi hitinazno aktivnost in vitro. To so opazovali kot odziv na prisotnost delov celične stene patogena v določenem časovnem obdobju. Ugotovili so, da je izražanje močno povišano takoj po izpostavitvi patogenu, nato pa sčasoma upade. Ta rezultat kaže na to, da sam patogen inducira izražanje hitinaze v kvasovki. Nato so izolirali celotno RNA, sintetizirali cDNA in pomnožili gen za hitinazo s PCR. Po rezanju z EcoRI so DNA ligirali v ekspresijski vektor pPIC9, ki so ga nato linearizirali s StuI in z elektroporacijo transformirali v kvasovko Pichia pastoris seva KM71. Kot negativno kontrolo so v kvasovko transformirali tudi vektor brez dodanega vključka. Čiščenje transformant so izvedli na minimalnem gojišču brez His. Po indukciji izražanja z metanolom so ob različnih časih gojenja dobili različne koncentracije hitinaze. Njeno aktivnost so preverili z uporabo p-(GlcNAc)3 kot substrata in iz tega sklepali na pravilno zvitje. Nato so opazovali tudi njen vpliv na glivo Monilinia fructicola in vitro. Ugotovili so, da učinkovito zavira rast in razmnoževanje glive glede na kontrolo. Za konec so preverili tudi njeno učinkovitost in vivo. V ta namen so breskve poškodovali in jih shranili na sobni temperaturi. Testni skupini so na poškodovane dele dodali dve različni koncentraciji hitinaze. Za primerjavo so nekaterim breskvam dodali tudi kvasovko AP47. Kot negativna kontrola pa so služile breskve, tretirane s kemičnim fungicidom tebukonazolom. Po določenem času so vsem dodali suspenzijo obeh vrst patogenov, jih naprej hranili na sobni temperaturi in po nekaj dneh primerjali razširjenost gnilobe. Tudi tu se je hitinaza izkazala kot uspešna pri zaviranju patogena. Kljub temu pa je bila manj uspešna kot antagonistični sev kvasovke AP47.

ZAKLJUČEK

Hitinaza iz kvasovke M. fructicola je dober kandidat za uporabo pri nadzoru gliv, ki povzročajo rjavo gnilobo sadja. Toda vsekakor so potrebne nadaljnje raziskave za razvoj učinkovite, človeškemu zdravju in naravi pa neškodljive metode zaviranja patogenov, ki bi omogočala večje pridelke sadja.

LITERATURA

Bush Elizabeth A. et al; Brown Rot on Peach and Other Stone Fruits; Virginia Cooperative Extension; 2015; publication 450-721

Banani Houda et al; Postharvest application of a novel chitinase cloned from Metschnikowia fructicola and overexpressed in Pichia pastoris to control brown rot of peaches; International Journal of Food Microbiology; 2015; 199; 54-61