BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva

LMU-TUM München: BiotINK - rethINK tissue printing, http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich 

Tehnologija biotiskanja

Biotiskanje je postopek priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  

Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  

Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije 10^-15 M, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10^-7 – 10^-11 M). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  

Membranski proteini

  Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: 

• Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA.
• Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. 

Priprava konstruktov

Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.   Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. 

Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  

Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  

Ligandi za membranske proteine 

V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.     

• Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  
• Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). 
• Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. 
• Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. 

   Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. 

Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. 

• PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. 
• Zeleni fluorescirajoči protein (GFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. 
• Goveji serumski albumin (BSA), ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. 

Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. 

Polimerizacijski poizkusi

Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, kot liganda pa sta služila biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    

Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.     Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  

Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  

Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi

Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika.

Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma.  Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja.

Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  

Viri

1. iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich 
2. Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. 

Seminarji SB 12016/17