Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo

The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered Nicotiana benthamiana <ref> LIMKUL, Juthamard, IIZUKA, Sayoko, SATO, Yohei, MISAKI, Ryo, OHASHI, Takao, OHASHI, Toya in FUJIYAMA, Kazuhito. The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered Nicotiana benthamiana plants. Plant biotechnology journal. Avgust 2016. Let. 14, št. 8, str. 1682–94. </ref>

Glukocerebrozidaza je encim, ki razgrajuje glukocerebrozid do glukoze in ceramida. Mutacije v genu za ta encim privedejo do kopičenja glukocerebrozida v lizosomih – Gaucherjeve bolezni, ki prizadene številna tkiva in organe. Za zdravljenje bolezni so potrebne redne intravenozne infuzije glukocerebrozidaze. Taka nadomestna encimska terapija je potrebna celo življenje in stane okrog 200 000 ameriških dolarjev letno na bolnika <ref> National Gaucher Foundation</ref>.

Za vstop glukocerebrozidaze v celice prek manoznega receptorja je pomemben končen manozni ostanek na glikoproteinu, saj ta usmerja transport v lizosome. Pri proizvodnji rekombinantne glukocerebrozidaze v sesalskih celicah je potrebna in vitro encimska modifikacija, ki izpostavi manozne ostanke na glikoproteinu. Pri proizvodnji v kulturi celic korenja se encim izraža v vakuoli, kjer imajo glikoproteini končni manozni ostanek, vendar pa so še vedno prisotni za rastline specifični N-glikani.

N-glikozilacija proteinov

Glikozilacija proteinov pri evkariontih se začne v endoplazemskem retikulumu že med translacijo – na nastajajočo polipeptidno verigo se z dolihol pirofosfata prenese oligosaharid iz glukoznih, manoznih in N acetilglukozaminskih ostankov (Glc₃Man₉GlcNAc₂). Reakcijo katalizira oligosaharid-protein transferaza, ki glikozilira asparaginske ostanke na zaporedju Asn X Ser/Thr, pri čemer je X lahko katerikoli aminokislinski ostanek razen prolina. Preden se glikozilirani protein prenese v Golgijev aparat, poteče encimska modifikacija oligosaharida do Man₈GlcNAc₂ <ref> LODISH, Harvey, BERK, Arnold, ZIPURSKY, S Lawrence, MATSUDAIRA, Paul, BALTIMORE, David in DARNELL, James. Protein Glycosylation in the ER and Golgi Complex. Iz knjige : Molecular Cell Biology. 4. izdaja. New York : W. H. Freeman, 2000.</ref>.

Do te stopnje je glikozilacija enaka pri vseh evkariontih, medtem ko se lahko nadaljevanje omenjenega procesa v Golgijevem aparatu med vrstami bistveno razlikuje. Pri rastlinah se z oligosaharida najprej odcepijo tri manozne enote, nato pa N-acetilglukozaminiltransferaza I na Man₅GlcNAc₂ doda eno enoto N-acetilglukozamina. Ta korak je nujen za nadaljnje pretvorbe oligosaharida, saj je nastali GlcNAcMan₅GlcNAcsub>2 substrat za več različnih encimov, ki procesirajo N-glikane. Za rastline so značilni kompleksni N-glikani, ki vsebujejo β-1,2-ksilozo ter α-1,3-fukozo in lahko pri ljudeh izzovejo imunski odziv <ref> STRASSER, Richard. Plant protein glycosylation. Glycobiology. September 2016. Let. 26, št. 9, str. 926–939. </ref>.

Priprava transgenske linije N. benthamiana s spremenjeno glikozilacijo proteinov

Rekombinantno človeško glukocerebrozidazo so že uspešno proizvajali v mutanti navadnega repnjakovca (Arabidopsis thaliana) cgl1, ki ne proizvaja kompleksnih rastlinskih N-glikanov, vendar pa bi bila proizvodnja v rastlini Nicotiana benthamiana (sorodnik navadnega tobaka) zaradi visokega izkoristka ekonomsko bolj ugodna.

V ta namen so Limkul in sodelavci pripravili transgensko linijo N. benthamiana z utišanim izražanjem N-acetilglukozaminiltransferaze I. Za utišanje so uporabili genski konstrukt, ki je vseboval zapis za RNA interferenco pod kontrolo promotorja in terminatorja iz virusa cvetačnega mozaika 35S.

Glikozilacijski profil proteinov, ki so jih izolirali iz transgenskih rastlin, so najprej preverili z imunoprenosom, kjer so uporabili protitelesa proti specifičnim rastlinskim N-glikanom, ki vsebujejo β-1,2-ksilozo ali α-1,3-fukozo, nato pa so iz proteinov sproščene oligosaharide analizirali s tekočinsko kromatografijo in s tandemsko masno spektrometrijo. V transgenski rastlini N. benthaniana ni prišlo do popolnega utišanja izražanja N-acetilglukozaminiltransferaze I, saj so bili še vedno prisotni specifični rastlinski N-glikani, vendar pa jih je bilo v primerjavi z divjim tipom bistveno manj.

Izražanje glukocerebrozidaze v liniji s spremenjeno glikozilacijo

Za proizvodnjo glukocerebrozidaze so križali že obstoječo linijo N. benthamiana, ki izraža rekombinanten encim, z linijo s spremenjeno glikozilacijo. Izražanje rekombinantne glukocerebrozidaze v križancih so analizirali z imunoprenosom in merjenjem encimske aktivnosti.

Glikozilacijo glukocerebrozidaze so preverili s protitelesi proti specifičnim rastlinskim N-glikanom in z masno spektrometrijo. Glukocerebrozidaza iz rastline z utišanim izražanjem N-acetilglukozaminiltransferaze I je večinoma vsebovala N-glikane manoznega tipa (do 85 %), medtem ko je encim proizveden v N. benthamiana divjega tipa vseboval samo specifične rastlinske N-glikane.

Učinkovitost vnosa rekombinantne glukocerebrozidaze so preverili na mišjih makrofagih, pri čemer je v celice prišlo več encima iz linije s spremenjeno glikozilacijo kot pa encima, ki je bil proizveden v rastlini divjega tipa.

Zaključek

Glikozilacija terapevtskih proteinov je pomembna tako za njihovo učinkovitost kot za varnost njihove uporabe. Predstavljeni članek je primer, kako bi lahko rastline s spremenjeno glikozilacijo lahko pripomogle k cenovno ugodni proizvodnji bolj varnih in učinkovitih biofarmacevtikov.

Viri

<references/>

---

Pojdi nazaj na MBT seminarji 2017.