Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

Onesnaževanje

Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju, zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Organofosfati so priljubljena alternativa sintetičnega pesticida zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj je visoko akutno toksičen.

Bioremediacija

Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja. Organofosfatna hidrolaza je bila identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

Vezikli zunanje membrane

Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

Priprava vektorskih konstruktov

Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material. Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina. Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosfatno hidrolazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi heksahis oznako, oba pa sta imela tudi lac operator. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

Analiza

Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosfatne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili s slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt hidrolize je barvni p-nitrofenol, ki ga je možno meriti spektrofotometrično.

Imobilizacija encima

V številnih primerih imobilizacije encima se je encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer so kot visoko prednost videli v tem, da encimska imobilizacija poteka in vivo, kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo. Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

Zaključek

Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfatnih pesticidov v okolju.

Viri

Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran MBT seminarji