Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R

Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from Lysinibacillus fusiformis C250R

Odkritje proteaze SAPFL

Proteaze predstavljajo 65%, detergenti pa 25% trga z encimi. Detergenti, ki so na trgu danes, slabo odstranjujejo proteinske madeže iz oblek, zato bi lahko z dodatkom proteaz povečali njihovo učinkovitost.

Nove encime je najpreprosteje odkriti v neraziskanih delih sveta. Potencialno zanimiv so zato ekstremofilni mikroorganizmi, ki za svoje preživetje potrebujejo encime z edinstvenimi lastnostmi. Pogoji v katerih živijo ti organizmi so precej podobni pogojem pri pranju perila. Raziskovalci iz Tunizije so ob raziskovanju tunizijskih črpališč nafte odkrili bakterije, ki v svojo okolico izločajo proteaze. V naravnem okolju jim služijo pri razgrajevanju nafte v okolici, raziskovalci pa so v njih videli potencialne tarče za uporabo v detergnetih.

Čiščenje proteaze in encimski testi

V vzorcih vode iz črpališč nafte so odkrili 4 bakterije, ki so kazale proteolizno aktivnost. Proteazo SAPFL so izolirali iz seva Bacillus licheniformis, ki je kazal sposobnost razgradnje nafte v vodi. Optimizirali so količino izoliranega proteina s spremembo vira ogljika in dušika ter spremebo 4 drugih parametrov. Proteazna aktivnost je bila izmerjena z modificirano Petersonovo metodo. Test proteazne aktivnosti je bil narejen po metodi po Touioui Boulkour in sod.

Sledilo je čiščenje proteaze. Uporabili so supernatant po centrifugaciji celične kulture, saj bakterije naravno izločajo proteazo SAPLF v svojo okolico. Supernatant so termično obdelali na 80°C in nato ob dodatku naraščajočih koncentracij amonijevega sulfata precipitirali. Precipitat so ponovno so raztopili v pufru MOPS. Raztopino so nato analizirali z metodama FPLC in HPLC, ki sta pokazali. Sledila je SDS-PAGE in analiza aminokislinskega zaporedja. Rezultati so pokazali, da je izoliran encim monomeren protein z 27 aminokislinskimi ostanki in ima proteolizno aktivnost. Raztopina je vsebovala malo primesi in je bila zato primerna za nadaljno analizo.

Sledile so raziskave vpliva inhibitorjev, reducentov in kovinskih ionov na encimsko aktivnost. Testirali so DFP, PMSF, SBTI, TLCK, TPCK, DTNB, NEM, jodoacetamid, leupeptin in pepstatin A. Inhibicija z DFP in PMFS je pokazala, da spada odkrita proteaza med serinske proteaze. Dodatek EDTA in soli z različnimi kovinskimi ioni je pokazala pomen prisotnosti Ca, Fe in Zn dvovalentnih ionov pri encimski funkciji.

Določili so tudi optimalni pH in temperaturo za delovanje in shranjevanje proteaze. Optimalna temperatura delovanja je bila 70°C, optimalen pH pa 11. Ti številki kažeta dobro odpornost proteaze. Odpornost pri visokih temperaturah pa se lahko še poveča z dodatkom poliolov, kot so PEG 1000, 1500, 6000, glicerol in ksilitol.

Kinetične lastnosti encima so testirali skupaj s 4 drugimi encimi na dveh substratih: kazein in sintetični peptid Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA. Vrednosti k(cat)/K(m) pri SAPLF so bile 2 do 7 krat večje v primerjavi z drugimi encimi.

Ključen dosežek raziskave je bil test stabilnosti ob prisotnosti pralnih praškov. Proteaza SAPFL je pokazala zelo dobro ohranitev proteazne funkcije ob dodatku detergentov. V primerjavi s kontrolo (proteaza brez dodanega detergenta) je aktivnost znašala od 75 do 84 %, odvisno od znamke uporabljenega detergenta. To je primerljiva številka z nekaterimi encimi, ki se že dodajajo k detergentom.

Da bi še dodatno pokazali uporabnost encima kot dodatka k detergentom, so raziskovalci iz Tunizije naredili test odstranjevanja krvnih madežev iz bombaža. Proteinski madeži, kot je krvni madež na kosu oblačila, so vedno predstavljali težave pri čiščenju. Poskus je pokazal, da madež ob dodatku SAPLF hitro izgine, medtem ko ga sam detrgent ne odstrani. Proteaza SAPLF je pokazala tudi boljšo aktivnost v primerjavi z »Alcalase Ultra 2.5 L«. To aktivnost nameravajo še izboljšati z dodatnimi raziskavami kodirajočega gena, 3d strukture proteina in analizo mutacij v zaporedju.