Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v bakteriji Escherichia coli, ki temelji na endogeni kontroli fermentacije

Butanol

Butanol je možni nadomestek tekočih goriv, saj se lahko kot 85-odstotni delež goriva uporabi pri večini bencinskih motorjev z notranjim zgorevanjem brez dodatnih predelav motorja. Nastaja pri fermentaciji biomase v organizmu Clostridium acetobutylicum. Prednosti butanola sta visoka oktanska in visoka energijska vrednost.

Priprava E. coli za sintezo 1-butanola

V študiji so konstruirali sistem za sintezo 1-butanola v bakteriji Escherichia coli pod endogenimi, nativnimi fermentacijskimi regulatornimi elementi (FRE). FRE vsebujejo promotor, vezavno mesto za ribosom in vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Uporabili so FRE_ackA, FRE_adhE, FRE_frd in FRE_ldhA.

Najprej so pripravili sev E. coli z delecijami genov za nativno pot fermentacije. Sev je imel delecije genov za laktat dehidrogenazo (ΔldhA), fumarat reduktazo (ΔfrdBC), alkohol dehidrogenazo (ΔadhE) in fosfotransacetilazo (Δpta). Posledica teh delecij je bil onemogočen metabolizem do sukcinata, laktata, etanola ter acetata.

Pripravili so tri različne plazmide, na katerih je bilo razporejenih 6 genov. Prvi plazmid je vseboval gene atoB (acetil-CoA acetiltransferaza), adhE2 (aldehid-alkohol dehidrogenaza), crt (3-hidroksibutiril-CoA dehidrataza), hbd (hidroksimaslena dehidrogenaza), drugi plazmid gen fdh (format dehidrogenaza), tretji pa gen ter (trans-enoil-CoA reduktaza). Z vnosom teh genov so omogočili biosintezno pot do 1-butanola. V vsakega od teh treh plazmidov so klonirali po 4 različne FRE in tako pridobili 64 različnih kombinacij. S temi plazmidi so transformirali prej pripravljeni sev E. coli.

Pripravljene bakterije so rastle v bogatem gojišču z glukozo, triptonom in kvasnim ekstraktom aerobno do stacionarne faze, temu pa je sledil preklop v anaerobno atmosfero, saj ta inducira sintezo 1-butanola. Sev s plazmidi, ki so vsebovali FRE_adhE::fdh, FRE_ackA::atoB-adhE2-crt-hbd in FRE_adhE::ter, je proizvajal najvišji titer 1-butanola, in sicer 3 g/L.

Ugotovili so, da je za sintezo 1-butanola v višjih koncentracijah v največji meri odgovorna aktivnost Fdh. Ta encim je odgovoren za redoks stanje v celici, saj pri svojem delovanju generira NADH. Da lahko glikoliza normalno poteka, se mora NADH oksidirati do NAD⁺. Presežek NADH v sevu E. coli z deletiranimi geni za nativno pot fermentacije poganja pot sinteze 1-butanola. Poskusili so, kako različni FRE vplivajo na izražanje fdh, in ugotovili, da ima Fdh največjo aktivnost, ko se izraža pod kontrolo FRE_adhE.

Analiza različnih vplivov na sintezo 1-butanola

Testirali so vpliv različnih koncentracij kisika v atmosferi na sintezo 1-butanola. Uporabili so sev z najboljšo kombinacijo plazmidov, ga gojili v različnih okoljih in ugotovili, da za začetek sinteze ni potrebna popolna odsotnost kisika, ampak se ta prične že v mikro-aerobnem okolju.

Ugotovili so tudi, da imajo na sintezo 1-butanola velik vpliv sestavine medija. Merili so titer 1-butanola v TB-mediju, v M9-mediju in v M9-mediju z dodanim ekstraktom kvasovk. Zaznali so padec titra 1-butanola v obeh M9-medijih, torej so kompleksna hranila za zadovoljivo sintezo 1-butanola nujno potrebna.

Pomemben je tudi čas prehoda v anaerobno atmosfero. Testirali so prehod v različnih fazah rasti celic in ugotovili, da prehod v anaerobno atmosfero v lag, eksponentni ali zgodnji stacionarni fazi povzroči podobno količino sintetiziranega 1-butanola, medtem ko je posledica prehoda v anaerobno atmosfero v pozni stacionarni fazi nizek titer 1-butanola. Do tega pride zaradi zmanjšanega izražanja proteinov pri veliki celični gostoti.

Prav tako so poskusili, kako poteka sinteza 1-butanola v odsotnosti induktorja in antibiotikov v gojišču in prišli do zaključka, da ti niso nujno potrebni za uspešno proizvodnjo 1-butanola, saj je bil titer v tem primeru 10 g/L v 24 h, izkoristek pa 0,25 g/g glukoze.

Zaključek

V tej študiji so raziskovalci uspešno skonstruirali sistem samoregulirane proizvodnje 1-butanola v bakteriji E. coli. Za industrijsko uporabo pa je treba sistem optimizirati in izboljšati sintezo 1-butanola v minimalnem mediju.

Vir

Wen RC, Shen CR. Self-regulated 1-butanol production in Escherichia coli based on the endogenous fermentative control. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):267.