Mutageneza celotnega genoma odkriva povezave med metabolnimi potmi in produkcijo aktinorhodina v Streptomyces coelicolor: Difference between revisions
| (2 intermediate revisions by the same user not shown) | |||
| Line 2: | Line 2: | ||
===Sekundarni metaboliti=== | ===Sekundarni metaboliti=== | ||
Pri streptomicetah poznamo okoli 20 gruč genov za proizvodnjo sekundarnih metabolitov, a so produkti večine v premajhnih koncentracijah, da bi jih zaznali. Za povečevanje njihove sinteze uporabljamo več metod med katere spadajo heterologno izražanje, povzročitev stresa zaradi pomanjkanja kovin ali hranil, dodajanje malih molekul, interakcije med mikroorganizmi, povečanje števila genov za biosintezno pot... Poznavanje biosintetskih poti je tako ključno za boljše razumevanje delovanja teh metod in njihovo načrtovanje. ''S. coelicolor'' je modelni organizem za proizvodnjo antibiotikov, ki spadajo med sekundarne metabolite. Proizvaja rdeči undecilprodigiozin (RED) in modri | Pri streptomicetah poznamo okoli 20 gruč genov za proizvodnjo sekundarnih metabolitov, a so produkti večine v premajhnih koncentracijah, da bi jih zaznali. Za povečevanje njihove sinteze uporabljamo več metod med katere spadajo heterologno izražanje, povzročitev stresa zaradi pomanjkanja kovin ali hranil, dodajanje malih molekul, interakcije med mikroorganizmi, povečanje števila genov za biosintezno pot... Poznavanje biosintetskih poti je tako ključno za boljše razumevanje delovanja teh metod in njihovo načrtovanje. ''S. coelicolor'' je modelni organizem za proizvodnjo antibiotikov, ki spadajo med sekundarne metabolite. Proizvaja rdeči undecilprodigiozin (RED) in modri aktinorodin (ACT). Slednji spada med poliketidne antibiotike in ga sintetizira poliketid-sintaza tipa II (PKS), ki je kompleks sestavljen iz več monofunkcionalnih proteinov zapisanih v gruči genov ''act''. ACT se sintetizira iz acetil-CoA in malonil-CoA [1]. | ||
===Mutageneza celotnega genoma=== | ===Mutageneza celotnega genoma=== | ||
Vpliv različnih genov na sintezo | Vpliv različnih genov na sintezo aktinorodina so preverjali z naključno mutagenezo celotnega genoma. Uporabili so sev ''S. coelicolor'' M145. Za mutagenezo so uporabili metodo na osnovi transpozona Tn5. Pripravili so vektor pHL734, ki vsebuje mesti za transpozicijo ter med njima ori pUC in zapis za odpornost proti antibiotiku apramicinu. Zunaj mest za transpozicijo ima plazmid oriT za prenos v ''S. coelicolor'', zapis za odpornost proti antibiotiku ampicilinu in zapis za hiperaktivno transpozazo Tn5 (Tnp(5)). Ta vsebuje 5 točkovnih mutacij, ki povečajo njeno aktivnost. S tem plazmidom so transformirali sev ''E. coli'' 12567, ki je vseboval pomožni plazmid pUZ8002, ki omogoča konjugacijo ''E. coli'' s ''S. coelicolor''. Po konjugaciji so ''E. coli'' odstranili z antibiotikom trimetoprimom in ''S. coelicolor'', kjer je prišlo do transpozicije selekcionirali z apramicinom. Ko se gen za Tnp(5) izrazi pride do enkratne transpozicije na naključno mesto v genomu, saj se pHL734 ne more replicirati v ''S. coelicolor'' in se tako gen za transpozazo izgubi. Mesta insercij so določili s pomočjo določitve nukleotidnega zaporedja, tako da so genomsko DNA izolirali in razrezali z restriktazo (''Apa''I). Produkti so se sami ligirali, nakar so z njimi transformirali ''E. coli'' DH5α. Iz kolonij odpornih na apramicin so izolirali plazmidno DNA in določili zaporedje z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi [1, 2]. | ||
===Vpliv genov na proizvodnjo | ===Vpliv genov na proizvodnjo aktinorodina=== | ||
Insercije transpozona so bile relativno naključne, izjema so le nekatera mesta z manjšim deležem G in C kjer je prišlo do intenzivnejše transpozicije. Od 988 mutantov, ki so jih naredili jih je 578 proizvajalo manj modrega pigmenta (ACT), 410 pa več. Produkcijo so kvantificirali z merjenjem absorbance pri 633 nm in jo primerjali z absorbanco starševskega seva. 69 mutantov je imelo insercijo v genih ''act'', ki zavzemajo 22,4 kb dolgo regijo na genomu. Po pričakovanjih so vse razen dveh povzročile upad ali popolno izničenje sinteze ACT. Z gensko trans-komplementacijo so določili, da je večina sprememb fenotipa posledica insercij transpozicijskega elementa (75 %), 25 % naj bi bilo lažno pozitivnih rezultatov, ki so posledica naključnih mutacij in ne transpozicije. Poleg komplementacijskega testa, so lahko vpliv gena na sintezo ACT potrdili tudi, če so identificirali večje število mutantov, ki so imeli transpozon vstavljen v različne dele enega gena in so vse insercije povzročile enak fenotip [1]. | Insercije transpozona so bile relativno naključne, izjema so le nekatera mesta z manjšim deležem G in C kjer je prišlo do intenzivnejše transpozicije. Od 988 mutantov, ki so jih naredili jih je 578 proizvajalo manj modrega pigmenta (ACT), 410 pa več. Produkcijo so kvantificirali z merjenjem absorbance pri 633 nm in jo primerjali z absorbanco starševskega seva. 69 mutantov je imelo insercijo v genih ''act'', ki zavzemajo 22,4 kb dolgo regijo na genomu. Po pričakovanjih so vse razen dveh povzročile upad ali popolno izničenje sinteze ACT. Z gensko trans-komplementacijo so določili, da je večina sprememb fenotipa posledica insercij transpozicijskega elementa (75 %), 25 % naj bi bilo lažno pozitivnih rezultatov, ki so posledica naključnih mutacij in ne transpozicije. Poleg komplementacijskega testa, so lahko vpliv gena na sintezo ACT potrdili tudi, če so identificirali večje število mutantov, ki so imeli transpozon vstavljen v različne dele enega gena in so vse insercije povzročile enak fenotip [1]. | ||
Latest revision as of 09:11, 25 April 2019
Grampozitivne streptomicete, med katere spada tudi Streptomyces coelicolor in sorodne aktinomicete proizvajajo številne antibiotike, imunosupresive, antihelmitike in antitumorske učinkovine, ki jih lahko uporabljamo v medicini. V njihovih genomih se nahajajo zapisi za encime številnih biosintetskih poti, zato nam lahko njihovo preučevanje prinese znanje o novih sinteznih poteh potencialnih zdravil [1].
Sekundarni metaboliti
Pri streptomicetah poznamo okoli 20 gruč genov za proizvodnjo sekundarnih metabolitov, a so produkti večine v premajhnih koncentracijah, da bi jih zaznali. Za povečevanje njihove sinteze uporabljamo več metod med katere spadajo heterologno izražanje, povzročitev stresa zaradi pomanjkanja kovin ali hranil, dodajanje malih molekul, interakcije med mikroorganizmi, povečanje števila genov za biosintezno pot... Poznavanje biosintetskih poti je tako ključno za boljše razumevanje delovanja teh metod in njihovo načrtovanje. S. coelicolor je modelni organizem za proizvodnjo antibiotikov, ki spadajo med sekundarne metabolite. Proizvaja rdeči undecilprodigiozin (RED) in modri aktinorodin (ACT). Slednji spada med poliketidne antibiotike in ga sintetizira poliketid-sintaza tipa II (PKS), ki je kompleks sestavljen iz več monofunkcionalnih proteinov zapisanih v gruči genov act. ACT se sintetizira iz acetil-CoA in malonil-CoA [1].
Mutageneza celotnega genoma
Vpliv različnih genov na sintezo aktinorodina so preverjali z naključno mutagenezo celotnega genoma. Uporabili so sev S. coelicolor M145. Za mutagenezo so uporabili metodo na osnovi transpozona Tn5. Pripravili so vektor pHL734, ki vsebuje mesti za transpozicijo ter med njima ori pUC in zapis za odpornost proti antibiotiku apramicinu. Zunaj mest za transpozicijo ima plazmid oriT za prenos v S. coelicolor, zapis za odpornost proti antibiotiku ampicilinu in zapis za hiperaktivno transpozazo Tn5 (Tnp(5)). Ta vsebuje 5 točkovnih mutacij, ki povečajo njeno aktivnost. S tem plazmidom so transformirali sev E. coli 12567, ki je vseboval pomožni plazmid pUZ8002, ki omogoča konjugacijo E. coli s S. coelicolor. Po konjugaciji so E. coli odstranili z antibiotikom trimetoprimom in S. coelicolor, kjer je prišlo do transpozicije selekcionirali z apramicinom. Ko se gen za Tnp(5) izrazi pride do enkratne transpozicije na naključno mesto v genomu, saj se pHL734 ne more replicirati v S. coelicolor in se tako gen za transpozazo izgubi. Mesta insercij so določili s pomočjo določitve nukleotidnega zaporedja, tako da so genomsko DNA izolirali in razrezali z restriktazo (ApaI). Produkti so se sami ligirali, nakar so z njimi transformirali E. coli DH5α. Iz kolonij odpornih na apramicin so izolirali plazmidno DNA in določili zaporedje z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi [1, 2].
Vpliv genov na proizvodnjo aktinorodina
Insercije transpozona so bile relativno naključne, izjema so le nekatera mesta z manjšim deležem G in C kjer je prišlo do intenzivnejše transpozicije. Od 988 mutantov, ki so jih naredili jih je 578 proizvajalo manj modrega pigmenta (ACT), 410 pa več. Produkcijo so kvantificirali z merjenjem absorbance pri 633 nm in jo primerjali z absorbanco starševskega seva. 69 mutantov je imelo insercijo v genih act, ki zavzemajo 22,4 kb dolgo regijo na genomu. Po pričakovanjih so vse razen dveh povzročile upad ali popolno izničenje sinteze ACT. Z gensko trans-komplementacijo so določili, da je večina sprememb fenotipa posledica insercij transpozicijskega elementa (75 %), 25 % naj bi bilo lažno pozitivnih rezultatov, ki so posledica naključnih mutacij in ne transpozicije. Poleg komplementacijskega testa, so lahko vpliv gena na sintezo ACT potrdili tudi, če so identificirali večje število mutantov, ki so imeli transpozon vstavljen v različne dele enega gena in so vse insercije povzročile enak fenotip [1].
Kot možne regulatorje so identificirali 570 genov (od tega 19 genov act), od tega 450 novih. Ugotovili so, da insercije v gene za biosintezo vitamina B12, ki je povezan z nastankom acetatnih gradnikov aktinorhodina, zmanjšajo sintezo ACT. Vitamin B12 je kofaktor, ki sodeluje pri zadnji stopnji razgradnje razvejanih aminokislin. Ta pa naj bi bila odgovorna za nastanek 50 % vseh prekurzorjev aktinorhodina [3]. Mutacije v encimih Krebsovega cikla prav tako vplivajo na sintezo ACT. Glutamat-dehidrogenaza specifična za NAD+ pretvarja glutamat v 2-okso-glutarat in tako poveča porabo acetil-CoA, mutacija v tem encimu povzroči nabiranje acetil-CoA, kar pomeni, da je ta bolj dostopen za sintezo ACT. Povečano sintezo ACT, a posledično slabo rast celic so opazili pri mutantih α-ketoglutarat-dekarboksilaze, ki predstavlja podenoto E1 v α-ketoglutarat-dehidrogenaznem kompleksu, ki nastopa v Krebsovem ciklu. Poleg že naštetih so raziskovalci odkrili še številne druge gene, katerih mutacije so povzročile spremembo sinteze ACT. Med te spadajo geni za oksidativno fosforilacijo, homeostazo celične stene, metabolizem DNA idr. [1].
Zaključek
Raziskovalci so tako identificirali 450 novih genov, ki potencialno vplivajo na sintezo aktinorhodina. S takim pristopom k mutagenezi celotnega genoma lahko identificiramo nove gene, ki so pomembni za metabolne poti v streptomicetah in drugih organizmih. Tako dobimo vpogled v sistem delovanja in možnost izboljšanja sinteznih poti antibiotikov in drugih sekundarnih metabolitov, ki predstavljajo nova potencialna zdravila.
Viri
[1] Z. Xu, Y. Li, Y. Wang, Z. Deng, and M. Tao, “Genome-Wide Mutagenesis Links Multiple Metabolic Pathways with Actinorhodin Production in Streptomyces coelicolor.,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 85, no. 7, pp. e03005-18, Apr. 2019.
[2] Z. Xu et al., “Large-Scale Transposition Mutagenesis of Streptomyces coelicolor Identifies Hundreds of Genes Influencing Antibiotic Biosynthesis.,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 83, no. 6, pp. e02889-16, Mar. 2017.
[3] K. Stirrett, C. Denoya, and J. Westpheling, “Branched-chain amino acid catabolism provides precursors for the Type II polyketide antibiotic, actinorhodin, via pathways that are nutrient dependent,” J. Ind. Microbiol. Biotechnol., vol. 36, no. 1, pp. 129–137, Jan. 2009.
