Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati

Uvod

Polihidroksianoati (PHAs) so polimeri pridelani s pomočjo bakterij. Te uporabljajo PHAs in druge polimere kot metodo za shranjevanje energije in ogljika v obliki znotrajceličnih granul. PHAs se tako da uporabljati kot netoksično, biorazgradljivo plastiko in ima podobne mehanične ter termičnelastnosti kot plastika pridelana iz nafte. Če pa pridelava PHAs želi tekmovati s plastiko pridelano iz nafte mora imeti primerljive stroške proizvodnje. Okoli 45 % cene proizvodnje PHAs lahko predstavlja samo vir ogljika za bakterije. Tako se kot potencialne nove vire energije in ogljika za bioreaktorje preiskuje hidrolizate odpadnega papirja in odpadkov iz papirnic (PPMS - pulp and paper mill sludge). Članek raziskuje in skuša optimizirati proizvodnjo PHAs z uporabo Bacillus thuringiensis in hidrolizatom PPMS ter proizvodno povečati z uporabo cikličnega feed-batch sistema.[1], [2]

Optimizacija fermentacije

Za fermentacijo so bile izbrane bakterije B. thuringiensis. Bakterijske vrste Bacillus naravno izražajo različne hidrolaze, ki tem bakterijam omogočajo metaboliziranje kompleksnih ostankov in lahko uporabljajo odpadne materiale kot vir ogljika. Kot vir energije in ogljika so izbrali hidrilozat PPMS. PPMS Je lignocelulozni odpadek papirne industrije, ki zaradi proizvodnje metana, neugodnih vonjav in drugih faktorjov predstavlja ekološki problem. Ker okoli 60 % PPMS sestavlja celuloza, bi hidrolizati lahko bili obetaven vir z glukozo bogatih virov ogljika za bioreaktorje. Vrsta B. thuringiensis, je že dokazano zmožna proizvajati PHBs (polihidroksibutirate) iz hidrolizatov kmetijskih odpadkov. Pri pripravi hidrolizata je bila najprej s kislo predobdelavo zmanjašana vsebnost pepela, nato pa je sledila hidroliza PPMS z -glukozidazo in celulazo. Hidrolizat ima visoko vsebnost glukoze, hkrati pa tudi sledi ksiluloze, manoze in nekaterih toksičnih substanc.[1], [3]

Pri optimizaciji fermentacije so spreminjali 4 faktorje. Vsebnost kvasnega ekstrakta, koncentracijo hidrolizata, čas inkubacije in pH fermentacijskega medija. Želeli so doseči čim večjo količino biomase in posledično večjo proizvodnjo PHAs. Kvasni ekstrakt v fermentacijskemu mediju predstavlja glavni vir dušika. Vsebuje velike količine peptidov, prostih aminokislin, ogljikovih hidratov, vitaminov in soli. Kvasni ekstrat zmanjša porabo vira ogljika in minimalizira nabiranje stranskih produktov, kar poskrbi za boljšo celično rast. Koncentracija hidrolizata je pomemben faktor pri optimizaciji fermentacije, saj hidroliza lignoceluloznih odpadkov poleg glukoze proizvede tudi tudi toksične stranske produkte (fenolne / aromatske spojine), ki lahko negativno vplivajo na proliferacijo celic. Uporaba 100 % hidrolizata zaradi prisotnosti toksičnih spojin vodi v nižjo koncentracijo celic. Z redčenjem hidrolizata lahko tako izboljšamo rast celic. K višji koncentraciji celic je vodil tudi daljši inkubacijski čas in pH okoli 7. Optimalna količina biomase je bila dosežena z uporabo 8,77 g/L kvasnega ekstrakta, 66,63 % hidrolizata, inkubacijskim časom 27,22 h in pH 7.18. [1]

Pri ciklični feed-batch fermentaciji (CFBF) se iz bioreaktorja periodično odstrani in doda nov medij. To omogoča bistveno večjo gostoto celic v bioreaktorju in višjo proizvodnjo želenega produkta. Pri klasični batch fermentaciji količina hranil in vira ogljika postane omejena, kar vpliva na nadalnjo rast celic, če pa rast celic pričnemo s preveliko količino substrata lahko pride do inhibicije s substratom. Pri CFBF z menjavo medija tudi preprečujemo nabiranje toksičnih stranskih produktov, kar nam omogoča delo z bistveno večjo količino biomase. Ko so testirali CFBF za proizvodnjo PHAs so izvedli 4 cikle po 29, 52, 65, in 72 h in po vsakem ciklu odstranili 20 % medija, ki so ga nadomestili s svežim medijem. Z vsakim novim ciklom so dosegli večjo količino biomase do četrtega cikla ko je ta nekoliko vpadla. V primerjavi z batch fermentacijo so z CFBF dosegli skoraj trikrat večjo količino biomase in štirikrat večjo koncentracija PHAs. [1]

Termične in mehanske lastnosti polimerov

Po izolaciji PHAs polimerov proizvedenih z batch in CFBF so analizirali sestavo in lastnosti polimerov. Pri analizi so odkrili precejšne razlike med polimerov proizvedenih pri batch fermentaciji in posameznimi cikli CFBF. V ciklih 2,3,4 so opazili nasaščajoči delež polihidroksivalerata (HV) in naraščajočo prisotnost polihidroksiheksanoata (HHX). To je vplivalo tudi na mehanične in termične lastnosti polimera. Polimerom iz ciklov 2,3,4 narašča maksimalna degradacijska temperatura (Tmax). To je precej ugodna lastnost ker omogoča obdelavo plastike pri višji temperaturi. Z zaporednimi CFBF cikli je polimerom tudi padala talilna temperatura (Tm), kar je tudi zaželjena lastnost za veliko aplikacij saj omogoča termično obdelavo pri nižji temperaturi. Pomembna lastnost za mehanične lastnosti plastike je stopnja kristalizacije (Xc). Xc je s cikli 1-4 upadala od 57 % do 34 %. Nižja Xc je za plastiko ponavadi ugodna lastnost, saj visoka stopnja kristalizacije pomeni da je plastika bolj krhka in manj prožna. Lastnosti pridobljenih polimerov so primerne za različne aplikacije in pogosto bolj ugodne kot pri komercialno dostopnih PHB. [1]

Zaključek

Z raziskavo so uspešno demonstrirali proizvodnjo PHAs z B. thuringiensis in uporabo hidrolizata PPMS kot vir ogljika. Uspešno so optimizirali pogoje fermentacije in z uporabo CFBF uspeli proizvodnjo PHAs bistveno povečati. Analiza proizvedenih polimerov je pokazala da zaporedni cikli CFBF proizvedejo polimere z različnimi termalnimi in mehaničnimi lastnostmi, ki so pogosto bolj ugodne kot lastnosti komercialno dostopnih polimerov.

Viri

1. S. Singh, B. Sithole, P. Lekha, K. Permaul, and R. Govinden, “Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate,” Bioresour. Bioprocess., vol. 8, no. 1, 2021.

2. A. Neelamegam, H. Al-Battashi, S. Al-Bahry, and S. Nallusamy, “Biorefinery production of poly-3-hydroxybutyrate using waste office paper hydrolysate as feedstock for microbial fermentation,” J. Biotechnol., vol. 265, no. September 2017, pp. 25–30, 2018.

3. S. Singh, B. Sithole, P. Lekha, K. Permaul, and R. Govinden, “Pretreatment and enzymatic saccharification of sludge from a prehydrolysis kraft and kraft pulping mill,” J. Wood Chem. Technol., pp. 10–24, 2021.