!MPACT

Nizozemska dodiplomska ekipa iz TU Eindhoven je leta 2022 na iGEM tekmovanju s projektom !MPACT zasedla prvo mesto v svoji skupini. Njihov projekt je dostopen na povezavi: https://2022.igem.wiki/tu-eindhoven/

Avtor povzetka: Jure Povšin

Problem

Trenutno trpi 3-5 % svetovnega prebivalstva za avtoimunskimi boleznimi in to število iz leta v leto narašča. Avtoimunske bolezni so posledica napak v delovanju imunskega sistema, ki povzroči imunski odziv proti molekulam lastnega telesa. Ekipa iGEM TU Eindhoven 2022 se je osredotočila na skupino redkih, a življenjsko nevarnih avtoimunskih bolezni, s skupnim imenom s citoplazemskimi protitelesi proti nevtrofilcem (ang. ANCA) povezan vaskulitis (ang. AAV). Gre za skupino hudih kroničnih motenj, za katere je značilno granulomatozno in nevtrofilno vnetje tkiva, ki povzroči nekrozo krvnih žil. To vodi do nezadostne oskrbe organov s kisikom, kar posledično privede do zmanjšanja delovanja tkiva ali njegovega odmiranja. Najbolj pogosta oblika AAV je granulomatoza s poliangiitisom (ang. GPA), zato je bila ta oblika tudi osrednja točka raziskovanja [1].

AAV je povezan s proizvodnjo patogenih ANCA protiteles. Večja koncentracija ANCA v telesu je povezana z večjo aktivnostjo bolezni. Ta protitelesa se vežejo na dva glavna antigena: levkocitno proteinazo 3 (PR3) in mieloperoksidazo (MPO). Večina primerov GPA ima avtoprotitelesa, ki se vežejo na PR3. Ti bolniki, pozitivni na PR3-ANCA, so izpostavljeni velikemu tveganju za ponovitev bolezni. Zato se celoten projekt posebej osredotoča na primere GPA, ki so pozitivni na PR3-ANCA [1].

Trenutno zdravljenje AAV in avtoimunskih bolezni na splošno so pogosto imunosupresivna zdravila, na primer rituksimab, ciklofosfamid ali prednizon, ki zavirajo imunski sistem. Ta trenutna zdravljenja so na splošno učinkovita, vendar so zaradi nespecifičnega zaviranja imunskega sistema povezana z obremenjujočimi stranskimi učinki in bolniki postanejo bolj nagnjeni k nalezljivim boleznim [1].

Rešitev

Da bi odpravili pomanjkljivosti trenutnih terapij proti AAV, je nizozemska iGEM ekipa oblikovala !MPACT: modularno in prilagojeno avtoimunsko celično terapijo. Ta celična terapija zazna ANCA avtoprotitelesa, ki so povezana z vaskulitisom. V prisotnosti ANCA nastane interlevkin-10 (IL-10), naravni protivnetni citokin, kar povzroči specifično utišanje avtoimunskega odziva. Terapija bi potekala tako, da se bolniku najprej odvzamejo imunske celice, nato se te celice gensko spremeni in pomnoži, nato pa se jih vrne nazaj v bolnika (podobna je CAR-T celični terapiji) [1].

!MPACT temelji na principu GEMS (ang. Generalized Extracellular Molecule Sensor), ki ga je opisal Scheller s sodelavci [2]. Gre za modularni sintezni receptor, ki omogoča prenos signala preko vezave zunajceličnega liganda na receptor, ki nato aktivira znotrajcelično signalno pot. V primeru !MPACT vezava patogenih ANCA avtoprotiteles na receptor vodi do dimerizacije in aktivacije receptorja, s čimer se začne signalna pot, ki povzroči proizvodnjo in lokalno sproščanje protivnetnega citokina IL-10. Lokalno sproščanje IL-10 naj bi imelo velik potencial pri zdravljenju avtoimunskih bolezni glede na literaturo [1].

Delovanje !MPACT je odvisno od koncentracije prisotnih ANCA. Višje koncentracije ANCA, tj. višja aktivnost bolezni, bodo povzročile večjo proizvodnjo IL-10, kar bo povzročilo močnejšo supresijo vnetja. Poleg tega je prisotnost ANCA nujno potrebna za proizvodnjo IL-10. Če ni prisotnih ANCA, tj. ni aktivnosti bolezni, celice "spijo" in zato ne bodo sproščale IL-10. Tako lahko na kontroliran način zdravimo GPA in preprečimo ponovitve bolezni [1].

Mehanizem delovanja

GEMS je sestavljen iz mutiranega eritropoetinskega receptorja (EpoR), vezanega na zunajcelično domeno, ki vsebuje proteinazo 3 (PR3), na katero se lahko vežejo ANCA. Poleg tega GEMS vsebuje domene za prenos signala (IL-6RB), ki lahko aktivirajo signalno pot JAK/STAT [1,2].

Po vezavi ANCA na domeno PR3 se zunajcelične afinitetne domene dimerizirajo, kar povzroči rotacijo vsake receptorske podenote okoli svoje osi. Posledica tega je spremenjena orientacija znotrajceličnih domen IL-6RB, kar posledično inducira JAK/STAT signalno pot. Slednja ima za posledico nastanek dimerjev STAT3, ki inducirajo transkripcijo gena IL-10, ki ga uravnava promotor STAT3. Po translaciji IL-10, ga celica samodejno izloča zaradi signalnega zaporedja Igk [1,2].

Cilj

Njihov cilj je bil pokazati, da se lahko sintezni receptor aktivira z vezavo protiteles in da lahko nato celice proizvedejo IL-10.

Načrt in izvedba

Analiza transfekcije in aktivacije receptorjev

!MPACT celice naj bi zadoščale dvema pogojema: ANCA protitelesa morajo prepoznati celico ter jo aktivirati in to bi moralo povzročiti izražanje izbranega terapevtskega proteina. Tem pogojem se lahko ugodi z uporabo GEMS receptorja. Slednji ima zunajcelični del, ki je sestavljen iz protiteles kamelje težke verige (VHH), ki specifično prepoznajo azo barvilo RR120. Dimerizacija receptorja, ki jo povzroči ligand, aktivira signalno pot JAK/STAT in to privede do sinteze SEAP (ang. Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase) [1].

Za določitev aktivacije receptorja so transfecirali HEK293T celice s sledečimi vektorji: pLEO619 (ki vključuje zapis za receptor GEMS, ki vsebuje RR120 VHH kot afinitetno domeno), pLS13 (vključuje del, ki omogoča izražanje SEAP) in pLS15 (vključuje del za izražanje STAT3). Nato je sledila aktivacija receptorja z ligandom RR120 ter meritev aktivnost SEAP v prisotnosti naraščajočih koncentracij RR120. Aktivnost SEAP so določili z vrednostmi absorbance (pri 405 nm) ter prišli do zaključka, da sistem deluje in da dobijo maksimalno aktivacijo receptorja pri 300 ng/mL RR120 [1].

Terapevtska ekspresija

Da bi dokazali, da bi lahko GEMS receptor spremenili za izločanje terapevtskega proteina, so zamenjali SEAP reporterski protein z IL-10 v ekspresijskem vektorju pLS13 z restrikcijo in ligacijo. Za potrditev izločanja terapevtskega proteina so podobno kot pri prejšnjem eksperimentu transfecirali HEK293T celice s sledečimi vektorji: pLEO619 (ki vključuje zapis za receptor GEMS, ki vsebuje RR120 VHH kot afinitetno domeno), pLS13-IL-10 (vključuje del, ki omogoča izražanje IL-10) in pLS15 (vključuje del za izražanje STAT3). Po tej transfekciji so celicam dodali različne koncentracije liganda RR120 za aktivacijo receptorja GEMS. Po približno 48-urnem inkubacijskem času so vzorce analizirali z IL-10 ELISA. Uspešno izražanje IL-10 so opazili pri vseh vzorcih, ki so bili inducirani z RR120 [1].

S tem so potrdili sposobnost transfeciranih celic, da proizvedejo IL-10 po aktivaciji GEMS receptorja. Poleg tega so pokazali, da so koncentracije IL-10 po indukciji receptorja z RR120 (300 ng/mL) približno 9 nanogramov na mililiter [1].

Aktivacija receptorja preko protiteles

Po uspešni ekspresiji IL-10 z uporabo GEMS receptorja so želeli ugotoviti, ali je možno receptor aktivirati tudi s protitelesi, saj zaenkrat ni podatka v literaturi, da bi bila takšna aktivacija možna. ANCA protitelesa morajo biti zmožna aktivirati GEMS receptor, saj so v izobilju prisotna v AAV. ANCA imajo afiniteto za proteinazo 3 (PR3), zaradi česar je ta protein primerna afinitetna domena za sintezni receptor. Vezava protiteles na receptor bi morala povzročiti dimerizacijo receptorja. Zato so preučili možnost uvedbe povezovalca med receptorjem (EpoR) in afinitetno domeno (PR3). To protitelesu omogoča, da se bivalentno veže na oba proteina PR3 v svojem optimalnem položaju. Protitelesa z identičnimi domenami za vezavo antigena se bivalentno vežejo na svoj ustrezni antigen, če je razdalja med antigenoma med 30 in 170 Å. EpoR in PR3 imata ocenjen premer 55 Å oziroma 45 Å, zato so želeli uvesti povezovalec z velikostjo med 10 Å in 60 Å [1].

Nato je bilo treba afinitetno domeno PR3 oblikovati tako, da bi lahko vezala ANCA. Nukleotidno zaporedje za oblikovanje te domene je bilo pridobljeno na UniProtu (ID: P24158). Želeli so tudi odpraviti prvotno biološko funkcijo proteina PR3 (hidroliza proteinov), zato so odstranili peptidno zaporedje pred zapisom za sam protein, saj naj bi bilo to zaporedje odgovorno za aktivacijo encima. Nizka afiniteta ANCA do PR3 bi lahko ovirala korak dimerizacije obeh afinitetnih domen ter željenega prenosa signala. Zato so naredili tudi dva spremenjena receptorja, pri katerih so uvedli HA oznako zraven PR3 domene. HA je zelo pogosto uporabljena oznaka za detekcijo proteinov, zato so na voljo tudi znana protitelesa, ki bi zaradi znane visoke afinitete do HA lahko aktivirala GEMS receptor. Da bi ugotovili, če ANCA protitelesa lahko aktivirajo GEMS receptor so transfecirali HEK293T celice s sledečimi vektorji: 0_PR3 in 8_PR3 (vključujeta zapis za GEMS receptor, ki vsebuje afinitetno domeno PR3 poleg bodisi 0 ali 8 aminokislin dolgih povezovalcev), pLS13 (vključuje del, ki omogoča izražanje SEAP) in pLS15 (vključuje del za izražanje STAT3). Uspešnost aktivacije receptorjev so merili z aktivnostjo SEAP. V nobenem primeru niso zaznali povišanega SEAP signala, zato so sklepali, da aktivacija receptorja ni potekla [1].

Zaradi neuspešnega eksperimenta, so uporabili prej omenjene receptorje, ki so vsebovali še HA oznako. Izvedba eksperimenta je bila enaka kot že prej opisano, le da so uporabili druge vektorje, ki so vsebovali zapis za HA oznako zraven PR3 domene pri receptorju. Za aktivacijo receptorja so tokrat uporabili protitelesa proti HA oznaki. Po merjenju aktivnosti SEAP ni prišlo do povišanega signala po dodatku protiteles, kar pomeni, da do aktivacije receptorja tudi v tem primeru ni prišlo. Ker jim ni uspelo aktivirati receptorja, so s pretočno citometrijo hoteli analizirati vezavo protiteles na GEMS receptor. Uporabili so receptorske vektorje s HA oznako ter z njimi transifecirali HEK293T celice ter jih ustrezno obarvali z označenimi protitelesi za FACS analizo. Iz rezultatov so ugotovili, da je bilo samo okoli 10% celic, ki so imela vezana protitelesa na svoje receptorje [1].

Zaključek

Z eksperimenti so potrdili, da se GEMS receptorji lahko uporabijo za izražanje terapevtskih proteinov (na primer IL-10). Poleg tega so tudi dokazali, da se protitelesa lahko vežejo na take receptorje, kar daje optimističen pogled za uporabo GEMS receptorjev pri zdravljenju raznih avtoimunskih bolezni v prihodnosti [1].

Viri

[1] Home | TU-Eindhoven - iGEM 2022 https://2022.igem.wiki/tu-eindhoven/ (pridobljeno 19. 5. 2023)

[2] L. Scheller, T. Strittmatter, D. Fuchs, D. Bojar, M. Fussenegger: Generalized extracellular molecule sensor platform for programming cellular behavior. Nat. Chem. Biol. 2018, 14(7), str. 723–729.