S svetlobo inducirana produkcija izobutanola in 3-metil-1-butanola z modificiranimi cianobakterijami

Povzeto po članku: S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

UVOD

Hitra rast svetovnega prebivalstva skupaj z naraščajočim povpraševanjem po fosilnih gorivih in povečanimi emisijami CO₂ je povzročila večjo potrebo po razvoju trajnostnih virov energije in kemikalij iz obnovljivih virov. V zadnjih desetletjih je bilo veliko raziskav osredotočenih na prepoznavanje trajnostnih metod za proizvodnjo obnovljivih biogoriv [1], [2].

Izobutanol je pomembna spojina kot alternativno gorivo zaradi visoke vsebnosti energije (98 % vsebnosti energije v bencinu) in nižjega parnega tlaka v primerjavi z etanolom. Poleg tega ima izobutanol nižjo vsebnost O₂ in nižjo topnost v vodi kot etanol, kar pomeni, da je mogoče v bencin vmešati več izobutanola, medtem pa imamo še vedno nizko vsebnost O₂ v končnem izdelku [2].

Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za sintezo izobutanola zaradi svoje sposobnosti, da s fotosintezo pretvarjajo CO₂ neposredno v kemične spojine z dodano vrednostjo. S cianobakterijami lahko proizvajamo etanol, izobutiraldehid, izobutanol, 1-butanol, sukcinat, 2,3-butandiol, terpenoide, klorofile, maščobne kisline, sladkor in aminokisline [3]–[5].

Zmožne so tudi vezati atmosferski dušik in zato zavzemajo pomembno vlogo v dušikovem ciklu. Cianobakterije, ki vežejo N₂, so še posebej zanimive za raziskovalce, ki se ukvarjajo z razvojem industrijskih sevov za proizvodnjo »zelenih« kemikalij, kot so limonen, farnezen, linalol in mircen [1].

SINTEZA IZOBUTANOLA IN 3-METIL-1-IZOBUTANOLA V CIANOBAKTERIJAH

Izobutanol in 3-metil-1-butanol sta pomembna alkohola, saj lahko služita kot alternativa bencinu in ju je mogoče sintetizirati po poti biosinteze aminokislin v cianobakterijah. Najpogostejša sintezna pot za biosintezo izobutanola je pot 2-keto kislin, ki si deli prekurzor (α-ketoizovalerat) s sintezno potjo biosinteze L-valina. 3-metil-1-butanol si deli prekurzor (2-ketoizokaproat) s sintezno potjo biosinteze L-levcina [2].

Biosintezna pot izobutanola vsebuje več encimov. Kodirajo jih geni alsS (Bacillus subtilis), ilvC (E. coli), ilvD (E. coli), ketokislinska dekarboksilaza (kdc) (Lactococcus lactis) in alkoholna dehidrogenaza (adh) (E. coli) [2], [3].

α-ketoizovalerat dekarboksilaza (Kivd oz. kdc) iz L. lactis, ki dekarboksilira α-keto kisline v aldehide, je pomemben encim v poti 2-keto kislin in je bil uporabljen pri E. coli, S.cerevisiae, Corynebacterium glutamicum in cianobakterijah za proizvodnjo izobutiraldehida in izobutanola. KDC je homotetramer, njegova optimalna aktivnost je bila opažena pri 45 °C (pH 6,5) in ima visoko specifičnost za α-ketoizovalerat. Poleg tega je bil Kivd oz. kdc zasnovan za uporabo večjega substrata za proizvodnjo alkoholov z daljšo verigo. Cianobakterije so pritegnile pozornost raziskovalcev zaradi zmožnosti izvajanja fotosinteze, in posledične porabe atmosferskega CO₂, ter nizke potrebe po hranilih, visoke tolerance na različna okolja in nezahtevnega genskega inženiringa [2].

MANIPULACIJA IZRAŽANJA GENOV V CIANOBAKTERIJAH

Večina pristopov sintezne biologije, ki delujejo v heterotrofnih organizmih, kot je E. coli, ni mogoče uporabiti v cianobakterijah. Na primer, promotorji in RBS, ki močno modulirajo izražanje genov v E. coli, ne delujejo dobro v cianobakterijah. Če se osredotočimo samo na povečanje izražanja genov s promotorskim inženiringom, opazimo, da se pri cianobakterijah uporabljajo močni konstitutivni nativni promotorji, sintetični inducibilni promotorji, kemično inducibilni promotorji in okoljsko inducibilni promotorji [5].

Do danes je bilo opisanihh le nekaj močnih konstitutivnih promotorjev, ki pa so pogosto omejeni na samo nekatere vrste in moč izražanja genov niha s cirkadianim ritmom. Sintetični inducibilni promotorji delujejo v različnih vrstah cianobakterij [5]. Kemično inducibilni promotorji, npr. arabinozni inducibilni promotor, so najpogosteje uporabljeni promotorji, vendar pa niso primerni za velike industrijske bioprocese [3], [5]. Uporaba zunanjih kemičnih induktorjev ni zaželena, saj poveča proizvodne stroške in predstavlja tveganje za okolje, na primer zaradi uporabe težkih kovin. Slednji problem lahko rešimo z uporabo promotorjev, na katere vplivajo okoljski oz. fizični signali kot sta npr. kisik in svetloba.

Znanstveniki so ustvarili s temo inducibilni genski ekspresijski sistem, ki temelji na dvokomponentnem sistemu EnvZ/OmpR iz E. coli. Prav tako so izkoristili prisotnost fikobilisoma v cianobakterijah. Ustvarili so na svetlobo občutljiv genski ekspresijski sistem, ki je sestavljen iz senzorja za zeleno svetlobo CcaS, efektorskega elementa CcaR ter promotor P_cpcG2, ki regulira ekspresijo gena za linker cpcG2 fikobilisoma. Na podlagi sistema za preklop iz aerobnega v anaerobni metabolizem (FNR) iz E. coli so ustvarili prilagojen sistem v sevu Syn6803 cianobakterij. Z uporabo tega sistema in promotorja P_FNR o ustvarili genski ekspresijski sistem, ki se odziva na prisotnost kisika [5].

VPLIV GENSKEGA EKSPRESIJSKEGA SISTEMA CcaS/CcaR NA EKSPRESIJO IZOBUTANOLA, 3-METIL-1-BUTANOLA IN CELIČNO RAST

V izbranem članku so avtorji želeli pokazati, da s svetlobo inducibilnim promotorjem lahko pridobimo večjo količino izobutanola in 3-metil-1-butanola in da so posledično bolj ekonomični ter obvladljivi genetski ekspresijski sistemi kot sistemi s kemikalijami inducibilnimi promotorji. Poleg tega so tudi vključili vpliv integracije tega genskega ekspresijskega sistema na rast cianobakterij [3].

Za gostiteljski organizem so izbrali cianobakterijo Synechocystis sp. PCC 6803. V E. coli K-12 so pripravili 3 različne konstrukte oz. vektorje z inserti [3].

Kot osnovo so uporabili vektor pKT-GSS. Prvi konstrukt so poimenovali pKT-GSS-KDC-ADH. Gena kdc in adh sta bila vstavljena za promotorjem P_cpcG2. Sev PCC 6803 ima integriran sistem CcS/CcR. Ta sistem lahko inducira izražanje eksogenih genov iz promotorja P_cpcG2 kot odziv na radiacijo z zeleno svetlobo in zavira izražanje genov kot odziv na radiacijo z rdečo svetlobo. V osnovni vektor so vstavili dva gena, potrebna za proizvodnjo alkoholov, in sicer kdc, ki vsebuje zapis za ketokislinsko dekarboksilazo (KDC) in je pridobljen iz L. lactis, ter slr1192, ki vsbuje zapis za alkoholno dehidrogenazo (ADH) in je pridobljen iz PCC 6803. Uporaba kodonov med sevom E. coli K-12 in PCC 6803 je podobna, zato ni bila potrebna optimizacija rabe kodonov za gen kdc. Pred zapisoma genov kdc in adh so vstavili sekvenco podobno Shine-Dalgarnovem zapordju iz gena cpcB organizma Synechococcus sp. PCC 7002. Ekspresija genov kdc in adh je bila inducirana z obsevanjem z zeleno svetlobo. Sinteza izobutanola in 3-metil-1-butanola je bila uspešna [3].

Rast, transkripcija in proizvodnjo izobutanola ter 3-metil-1-butanola so določili z gojenjem celic PCC 6803ΔGSS. To je sev z delecijo genomskega sistema CcaS/CcaR in P_cpcG2. V ta sev so vnesli vektor pKT-GSS-KDC-ADH in nato celice obsevali z rdečo in zeleno svetlobo (induktivni pogoji: 520 nm, 660 nm; 60 μmol/m² s) ali samo z rdečo svetlobo (660 nm, 30 μmol/m² s). Rdeča svetloba je potrebna za fotosintezo in ni znatno vplivala na ekspresijo genov pod promotorjem P_cpcG2. Zaradi slednjega razloga so celice obsevali tako z zeleno kot rdečo svetlobo. Spremembe v intenzivnosti in/ali valovni dolžini svetlobe lahko aktivirajo metabolizem gostitelja, rast celic in bioprodukcijo. Čeprav je bila za indukcijo uporabljena dvakrat večja intenziteta svetlobe, so pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo opazili rahlo zakasnitev rasti celic v primerjavi z obsevanjem z rdečo svetlobo. Zakasnitev v rasti celic so pripisali integraciji genov kdc in adh v genom. Slednje ni znatno vplivalo na produkcijo alkoholov [3].

Opazovali so tudi transkripcijsko aktivnost celic. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo so v celicah PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH opazili petkrat višjo raven transkripcije gena kdc v primerjavi s tisto pri osvetlitvi z rdečo svetlobo pri 4 urah. Slednje ponovno potrdi njihovo domnevo [3].

Titri proizvodnje izobutanola in 3-metil-1-butanola so se povečevali do petega dne pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo ter dosegli 166 mg/L izobutanola in 51 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa je sev PCC 6803ΔGSS z pKT-GSS-KDC-ADH proizvedel samo 19 mg/Lizobutanola in 9 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh [3].

Ustvarili so tudi kontrolni sev. Ta sev je imel zapise za gena kdc in adh pod nadzorom močnega konstitutivnega promotorja P_trc-core. Koncentracija izobutanola, proizvedena v kontrolnem sevu, je znašala približno 5 mg/L, koncentracija 3-metil-1-butanola pa je bila pod mejo zaznave. V primerjavi s sevom s sistemom CcaS/CcaR je kontrolni sev počasno rastel [3].

Raziskovalci so želeli nadaljnjo povečati proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola, kar je pomenilo, da so morali povečati nivoje izražanja kdc in adh iz P_cpcG2. Njihove prejšnje raziskave so pokazale, da je dodatna ekspresija gena ccaR z uporabo konstitutivnega promotorja povečala ekspresijo genov iz P_cpcG2, vendar se je povečalo tudi puščanje tega promotorja. Puščanje promotorja in nizko razmerje ON/OFF (indukcija/brez indukcije) sta negativno vplivala na proizvodnjo alkoholov. Da bi se izognili puščanju promotorja, se mora gen ccaR izražati le takrat, kadar celice obsevamo z zeleno svetlobo. Zato so v vektor vnesli dodaten gen ccaR pod promotor P_cpcG2 [3].

Vektor pKT-GSS-KDC-ADH-CcaR je bil konstruiran z vstavitvijo dodatnega gena ccaR z zaporedjem podobnim Shine Dalgarnovem (SD) za genom adh v vektorju pKT-GSS-KDC-ADH. S tem vektorjem so transformirali sev PCC 6803ΔGSS. Pri obsevanju z rdečo in zeleno svetlobo je sev proizvedel 238 mg/L izobutanola in 75 mg/L 3-metil-1-butanola v 5 dneh. Pri obsevanju z rdečo svetlobo pa sta se izobutanol in 3-metil-1-butanol pojavila samo v sledovih. Dodatna ekspresija gena ccaR je izboljšala proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola za 1,5-krat oziroma 1,4-krat [3].

ZAKLJUČEK

Rast svetovnega prebivalstva in povečano povpraševanje po fosilnih gorivih sta povzročila potrebo po razvoju trajnostnih virov energije. Cianobakterije so privlačni mikroorganizmi za proizvodnjo trajnostnih biogoriv, saj lahko s fotosintezo pretvarjajo atmosferski CO₂ v kemične spojine. Izobutanol je pomemben kot alternativno gorivo, saj ima visoko vsebnost energije in nižji parni tlak kot etanol. V tem kontekstu so znanstveniki razvili s svetlobo inducibilni genski ekspresijski sistem v cianobakteriji Synechocystis sp. PCC 6803 za proizvodnjo izobutanola in 3-metil-1-butanola. Sistem se je izkazal za uspešnega za sintezo teh alkoholov pod vplivom zelene svetlobe.

Viri

[1] T. J. Johnson, J. L. Gibbons, L. Gu, R. Zhou, and W. R. Gibbons, “Molecular genetic improvements of cyanobacteria to enhance the industrial potential of the microbe: A review,” Biotechnol. Prog., vol. 32, no. 6, pp. 1357–1371, 2016, doi: 10.1002/btpr.2358.

[2] R. Miao, X. Liu, E. Englund, P. Lindberg, and P. Lindblad, “Isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 using heterologous and endogenous alcohol dehydrogenases,” Metab. Eng. Commun., vol. 5, no. June, pp. 45–53, 2017, doi: 10.1016/j.meteno.2017.07.003.

[3] S. Kobayashi, S. Atsumi, K. Ikebukuro, K. Sode, and R. Asano, “Light-induced production of isobutanol and 3-methyl-1-butanol by metabolically engineered cyanobacteria,” Microb. Cell Fact., vol. 21, no. 1, pp. 1–11, 2022, doi: 10.1186/s12934-021-01732-x.

[4] S. Kobayashi et al., “Application of an engineered chromatic acclimation sensor for red-light-regulated gene expression in cyanobacteria,” Algal Res., vol. 44, no. October, p. 101691, 2019, doi: 10.1016/j.algal.2019.101691.

[5] A. Satta, L. Esquirol, and B. E. Ebert, “Current Metabolic Engineering Strategies for Photosynthetic Bioproduction in Cyanobacteria,” Microorganisms, vol. 11, no. 2, pp. 1–34, 2023, doi: 10.3390/microorganisms11020455.