Cellect

Predstavitev projekta je dostopna na povezavi: https://2023.igem.wiki/freiburg/.

Cellect je projekt ekipe iz Freiburga, ki je leta 2023 tekmovala na iGEM sintenzem tekmovanju. Želeli so rešiti težavo s fenotipsko nestabilnostjo transformiranih celic. Znano je namreč, da so transformirane celice slabo fenotipsko stabilne, tudi če nanje konstranto izvajamo selekcijski pritisk za antibiotikom. Težava se predvsem odraža kadar povečamo proizvodnjo, "gremo na večjo skalo". [1,2]

Komponente sistema

Naredili so avtoregulatorni sistem, kjer je preživetje celic odvisno od proizvodnje tarčne molekule. Sistem temelji na uporabi treh komponent: 1. tarčno specifičnem RNA-stikalu, 2. toksin-antitoksin sistemu in 3. tarčni molekuli (molekuli, ki se proizvaja). Ekipa je predstavila delovanje njihovega konstrukta na primeru proizvajanja vitamina B12 oz. njegove biološko dostopne oblike adenozilkobalamina (AdoCbl) v Escherichia coli. [1]

Tarčno specifično RNA-stikalo je mRNA, ki je sestavljena iz tarčno specifičnega aptamerja in zapisa za protein. Na splošno je lahko zapisan kateri koli protein. V primeru Cellecta, je zapisan toksin. Aptamer ima lastnost, da se ob vezavi s ligandom oz. tarčno molekulo, konformacijsko spremeni. S konformacijsko spremembo omogoča ali neomogoča transkrpicijo in translakcijo zapisanega proteina za njim. Njegov vpliv na transkripcijo se kaže, tako da aptamer tvori sekundarno strukturo, ki ob dodatku zaporedja bogatega z uracilom povzroči odcep RNA-polimeraze. Vpliv na translacijo pa je preko ribosom vezavnega zaporedja, ki se nahaja v strukturi aptamerja. Kadar je aptamer v določeni konformaciji (lahko je ob vezavi liganda ali ne) onemogoča vezavo ribosoma in tako translacija ni mogoča. V primeru proizvajanja adenozilkobalamin (AdoCbl) je to ligand, ki povzoči konformacijsko spremembo aptamerja. Aptamer, ki so ga uporabili so vzeli iz iz 5´-UTR regije gena btuB v E.coli. Gen btuB zapisuje transportni protein BtuB, ki je odgovoren za prenos vitamina v celico. V kolikor AdoCbl ni vezan na aptamer ta omogoča transkrpicijo in translacijo toksina. Če je pa nanj vezan AdoCbl pa transktipcija in translacija toksina nista mogoči. [1, 3]

Sistem toksin-antitoksin je tisti, ki omogoča selekcijo bakterij, ki proizvajajo produkt od tistih, ki ga ne. Sistemi so pogosto prisotni v bakterijah in jih je tudi veliko različnih. Gre za osnoven princip, kjer tarčna molekula preko posrednega mehanizma vpliva na izražanje toksina ali antitoksina, kar vodi v spremembo ravnotežja v sistemu. Pri projektu Cellect so uporabili lastnost aptamerja tako, da ob vezavi tarčne molekule nanj, spremeni konformacija in onemogoči transkripcijo in translacijo toksina. V primeru sinteze vitamina B12 v E. coli so vzeli sistem toksin-antitoksin MazE/MazF iz E. coli. MazF je endonukleaza, ki cepi mRNA, kar vodi v celično smrt. MazE je inhibitor endonukleaze MazF. Dva MazE proteina se združita v dimer, ki inhibirajo štiri MazF endonukleaze. [1, 4]

Tarčna molekula je molekula, ki jo želimo proizvajati v transformiranih celicah. V primeru proizvodnje vitamina B12 je to adenozilkobalamin. Za sintezo v bakterijah bi sicer potrebovali vnesti 28 encimov, ampak ker ima E. coli pot reciklaže lahko sintetiziramo po alternativni poti. Tako je v celico potrebno vnesti le encim BluB, ki pretvarja v celici naravno prisoten flavin mononukleotid (FMN) v 5,6-dimetilbenzimidazola (DMB). Ob dodatku kobinamida (Cbi) in sintetizranem DMB-ju poteče kaskada v celici naravno prisotnih encimov BtuR, CobU, cobT, CobS in CobC, ki sintetizirajo tarčno molekulo AdoCbi. [1, 5]

Sintetiziranje vektorja

Komponente so klonirali v vektor preko Golden Gate kloniranja. To je kloniranje, ki uporablja restriktaze tipa 2S. Metoda je enostavna in hitra, saj združuje restrikcijo in ligacijo v enem postopku. Omogoča sestavljanje več fragmentov z edinstvenimi previsnimi bazami, kar omogoča ligacijo tudi do 10 fragmentov v enem koraku. Ta metoda ima dobro učinkovitost. Konstrukti, ki so ustvarjeni s to metodo, so lahko brez brazgotin, za razliko od nekaterih drugih tehnik kloniranja pri sintezni biologiji, npr. standard 10. Ta metoda je tudi cenejša od mnogih komercialnih metod kloniranja. Pogosto se uporablja tudi pri tekmovanju iGEM, kot tudi na splošno v sintezni biologiji. Sintetizirali so plazmid s 3 regijami: 1. zapis za encim BluB in RNA-stikalo (aptamer in toksin MazF), 2. zapis za antitoksin MazE in 3. rezistenca proti antibiotiku kloramfenikolu. Zapis za encim BluB in RNA-stikalo so dali na isti inducibilni promotor, ker so želeli kontrolirati začetek produkcije tarčnega proteina in toksina. Izbrali so promotor Tet. Lahko bi ju dali na ločen induciabilni promotor, ampak so zaradi preprostosti izvedbe uporabili le enega. Za izražanje antitoksina pa so izbrali konstitutivni promotor Amp. Konstitutivni promotor so izbrali, ker sinteza vitamin B12 zahteva več časa kot sinteza toksina, saj vključuje encimske reakcije. Tako so omogočili, da ima celica malenkost časa, preden se pojavijo znaki toksičnosti. Vsak vektor pa potrebuje tudi antibiotsko rezistenco za selekcijo. V tem primeru so izbrali rezistenco proti kloramfenikol. [1, 6]

Delovanje sistema

Preden so sestavili komponente med seboj so jih samostojno testirali in/ali optimizirali.

Izbira aptamerja

Za izbiro primernega aptamerja so izdelali biosenzor. Biosenzor deluje tako, da ob indukciji promotorja LacI in odsotnosti AcoCbi pride do nastanka LacI, ki deluje kot represor promotorja Trc, zato ne pride do izražanja sfGFP. V primeru, da je prisoten AdoCbi se ta veže na aptamer in prepreči sintezo LacI, zato promotor Trc ni zavrt in pride do sinteze sfGFP. Testirali so tri različne aptamere (K12, SY in PF). Aptamera K12 in SY sta iz gena btuB. K12 prihaja iz E. coli, SY pa iz Salmonella typhimurium/enterica. Po delovanju in učinkovitosti sta si precej podobna. PF je iz gena cbiB (zapisuje adenozilkobalamid-fosfat sintetazo) iz Propionibacterium. Ta aptamer je primeren za uporabo v cianobakterijah, saj omogoča prepoznavo adenozilkobalamina od adenozilkobalamida. Kot že omenjeno so se odločili za uporabo K12 aptamera. [1]

Iz rezultatov prvih testiranj so ugotovili, da potrebujejo močnejši RBS, saj je prišlo do produkcije LacI tudi če je bil AdoCbi vezan na aptamer. Modificiral pa so tudi aptamer vezavno mesto za AdoCbi tako, da so zmanjšali afiniteto za njegov prekurzor Cbi. [1]

Izražanje sistema toksin-antitoksin

Prvotno so testirali sistem brez antitoksina, a so ugotovili, da se celična smrt prehitro sproži. Težava je bila, da je promotor Tet puščal in je celica že pred indukcijo proizvajala toksin in se zastrupljala. Zato so vstavili še antitoksin. Oba so dali pod isti induktivni promotor Tet. Ugotovili so, da je celična smrt posredovana preko toksina tokrat prepočasna, komaj po 2,5 urah. Celično breme bi bilo preveliko, saj bi tem času celica narediti preveč toksina in antitoksina. Hkrati pa ne želimo prevelike sinteze antioksina, saj se za sintezo antitoksina MazE in encima BluB se izrabljajo isti viri. Zato so se odločili, da antitoksin dajo pod šibek konstitutivni promotor Amp. Konstitutivni promotor daje celici zaščito pred stresom, ki ga povzroči toksin za vsaj 90min. S tem ko so uporabili konstitutivni promotor so povzročili konstantno sintezo antitoksina. Na tak način dosežejo, da je pred indukcijo toksina in encima BluB, koncentracija antitoksina že konstantna.[1]

Optimizacija encima BluB

Ugotovili so da mora biti encim BluB v dimerni obliki, da učinkovito veže substrat FMN v aktivno mesto. Gen je zapisan kot monomer, a se protein kasneje poveže v dimer. Če bi zmanjšali prostost monomerov, bi lahko zmanjšali celično obremenitev. Zato v prihodnosti želijo narediti dimerni BluB. [1]

Sledilo je tesiranje celotnega sistema, kjer so ugotovili, da je minimalna koncentracija AdoCbi za uspešno inhibicijo celične smrti 20 nM. Da celica ne prestopi praga celičnega stresa pa še nekoliko višja, okoli 20,2 nM. V primeru, da celica ne proizvaja tarčne molekule se celičen stres sproži, ko je koncentracija toksina dvakrat večja kot koncentracija antitoksina (1 uro po indukciji). Celice pa začnejo odmirati po nekje 2 urah. [1]

Izboljšave sistema

Tekom testiranja so opazili, da jim promotor Tet pušča in da je dovzeten za mutacije. Hkrati so ugotovili, da je tudi gen mazF dovzeten za mutacije. Da bi rešili težavi so modificirali vektor, tako da so encim BluB in RNA-stikalo dali pod različna promotorja. Oba sta še vedno promotorja Tet. Pred zapisom za RNA-stikalo so dodali še selekcijski marker, ki zapisuje rezistenco proti kanomicinu. Če pride do mutacije v promotorju Tet in da ta ni več učinkovit, bodo celice izgubile rezistenco proti kanomicinu. [1]

Viri

[1] iGem Freiburg 2023 - Cellect. https://2023.igem.wiki/freiburg/description

[2] Rugbjerg P, Myling-Petersen N, Porse A, Sarup-Lytzen K, Sommer MOA. Diverse genetic error modes constrain large-scale bio-based production. Nature Communications. 2018 Feb 20;9(1). Dostopno na: https://doi.org/10.1038/s41467-018-03232-w.

[3] Barrick, J.E., Breaker, R.R. The distributions, mechanisms, and structures of metabolite-binding riboswitches. Genome Biol 8, R239 (2007). Dostopno na: https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-11-r239.

[4] Engelberg-Kulka, H., Hazan, R., Amitai, S. MazEF: a chromosomal toxin-antitoxin module that triggers programmed cell death in bacteria. J Cell Sci 1 October 2005; 118 (19): 4327–4332. Dostopno na: https://doi.org/10.1242/jcs.02619.

[5] Fang, H., Li, D., Kang, J. et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for de novo biosynthesis of vitamin B12. Nat Commun 9, 4917 (2018). Dostopno na: https://doi.org/10.1038/s41467-018-07412-6.

[6] Bird, J. E., Marles-Wright, J., Giachino, A. A user’s guide to golden gate cloning methods and standards. ACS Synth Biol. 2022, Nov 18, 11(11). Dostopno na: https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00355.