LAMPS

LAMPS (Luminous Algae Material Presenting System) je projekt s katerim je skupina ShanghaiTech-China leta 2023 sodelovala na tekmovanju iGEM in prejela zlato medaljo, ter nominacijo za najboljši projekt podnebne krize.

Avtorica povzetka: Rebeka Jerina

Problem

Podnebna kriza predstavlja enega glavnih problemov s katerim se dandanes srečuje svetovno prebivalstvo. Globalne temperature in morska gladina nenehno naraščajo, ekstremni vremenski pojavi so vse pogostejši, ozonski plašč se tanjša, biotska raznovrstnost pa upada. Glavni krivci za naštete spremembe so fosilna goriva (premog, nafta in zemeljski plin), ki predstavljajo kar dve tretjini svetovnih emisij ogljikovega dioksida. Njihova poraba oz. povpraševanje, po podatkih Združenih narodov (United Nations), predstavlja 80 % svetovnega povpraševanja po primarni energiji. Samo na Kitajskem poraba premoga za proizvodnjo električne energije za leto 2021 presega 1,57 milijarde ton, poraba zemeljskega plina pa 182,7 milijarde kubičnih metrov. Velik del električne energije se porabi za razsvetljavo. Na Kitajskem slednja predstavlja kar 10–12 % celotne proizvodnje električne energije. Razsvetljava tako povzroča ogromno okoljsko škodo, zato je potrebno poiskati čistejše rešitve za reševanje tega problema [1].

Rešitev

Trajnosten in »zeleni« način razsvetljave bi lahko predstavljal LAMPS (Luminous Algae Material Presenting System). Gre za sistem svetlečih alg, ki uporablja sončno energijo in s pomočjo fuzijskih proteinov s tehnologijo bioluminiscenčnega resonančnega prenosa energije (BRET) oddaja svetlobo v vidnem spektru. Sistem osvetljevanja je tudi samodejno uravnavan s cirkadianim ritmom (dnevno-nočnim ciklom) in v celoti biorazgradljiv. Produkt sestavlja tekoča kultura modrozelenih alg in zaprta posoda v kateri se slednja nahaja. Zaradi omenjenega načina zasnove, se LAMPS lahko uporablja v mnogih aplikacijah (ambientna osvetlitev, svetleče vodne igrače, oznake za nujno pomoč, strehe javnih zgradb, talne oznake, itd.) [1].

Zasnova sistema LAMPS

Ogrodje in osnova

Za ogrodje sistema bi uporabili sev cianobakterije Synechococcus elongatus PCC7942, ki se pogosto uporablja kot modelni organizem za raziskave metabolizma in genetskih modifikacij. Ker omenjena vrsta ni sposobna vzdrževati eksogenih plazmidov, bi rekombinantne gene integrirali v genom z uporabo homologne rekombinacije, na že poznana nevtralna mesta (NSI-III; Neutral Insertion Sites) [1].

Osnovo sistema LAMPS pa bi predstavljal operon luxCDABE, ki kodira reduktazo maščobnih kislin LuxCE (ang. fatty acid reductase), transferazo maščobnih aldehidov LuxD (ang. fatty aldehyde transferase) in oksidazo maščobnih aldehidov LuxAB (ang. fatty aldehyde oxidase). LuxD pretvarja miristol-ACP v maščobne kisline, LuxCE reducira nastale maščobne kisline v maščobne aldehide, LuxAB pa tekom oksidacije maščobnih aldehidov oddaja svetlobo modre barve (490 nm). Gre torej za heterodimerni encim luciferazo prisotno v mnogih luminiscenčnih bakterijah [1].

Za povečanje intenzivnosti oddane svetlobe bi v sistem dodali še LuxF in LuxG. Predhodna študija je namreč pokazala, da dodatek LuxF aktivira luciferaze (sestavljene iz LuxA in LuxB) z vezavo na inhibitor luciferaz. LuxG pa kot FMN reduktaza prav tako prispeva k luminiscenci s sintezo dodatnih substratov FMNH2 [2,3].

Izboljšave

Uvedli bi še nekaj dodatnih izboljšav za učinkovitejšo in enostavnejšo uporabo sistema LAMPS.

Za izboljšanje svetlosti in barvitosti bakterijskega fluorescenčnega sistema luxCDABE bi uporabili biofluorescenčni resonančni prenos energije (BRET - Biofluorescence Resonance Energy Transfer). Slednji vključuje fuzijo donorskih in akceptorskih fluorescenčnih proteinov in temelji na dejstvu, da lahko donorsko barvilo v vzbujenem stanju prenese del svoje energije preko ne-sevalne dipol-dipolne sklopitve na akceptorsko molekulo. Na C-konec LuxB bi torej preko povezovalca pritrdili fluorescenčni protein in ustvarili nov fuzijski fluorescenčni protein, ki bi zaradi BRET oddajal intenzivnejšo svetlobo druge barve. Ker bi se emisijski spekter kompleksa LuxA-LuxB do določene mere prekrival s spektrom vzbujanja fluorescenčnega proteina v fuziji, bi, ko bi bila slednja dovolj blizu drug drugemu (≤10 nm), lahko kompleks LuxA-LuxB v vzbujenem stanju napravi dipol-dipolno resonanco s fluorescenčnim proteinom v fuziji, pri čemer bi prenesel lastno energijo na fluorescenčni protein na ne-sevalni način. To bi povzročilo, da fluorescenčni protein v fuziji odda svetlobo z drugačno frekvenco in amplitudo. Učinkovitost BRET je povezana s šesto potenco razdalje med proteinom donorjem fluorescence in proteinom akceptorjem fluorescence, zato z regulacijo razdalje lahko spreminjamo valovno dolžino svetlobe in s tem barvo fluorescence [1].

Za boljšo priročnost, trajnost in vzdržljivost sistema bi gene odgovorne za fluorescenco (luxAB) zapisali pod promotor z ritmičnim izhodom, pKaiBC, gene odgovorne za izdelavo in shranjevanje substratov potrebnih za fluorescenčno oksidacijo (luxCDEFG) pa pod močni konstitutivni promotor pPsbA. S tem bi dosegli periodično regulacijo luminiscence in zagotovili samodejno »vklapljanje« LAMPS ponoči in »izklapljanje« podnevi [1].

Prilagodili bi tudi metabolizem cianobakterij tako, da bi podnevi sintetizirale in akumulirale čim več substratov in energije za oskrbo nočne osvetlitve. V ta namen bi v sistem dodali protein Hfq in siRNA za utišanje izražanja gena glgC, ki kodira D-glukoza-6-fosfat translokazo. Z utišanjem slednje bi zmanjšali sintezo glikogena in povečali proizvodnjo saharoze, s čimer bi povečali učinkovitost fotosinteze. Gena za protein Hfq in siRNA bi vstavili pod kontrolo konstitutivnega promotorja [1, 4].

Poleg tega, bi zasnovali izražanje piruvat dehidrogenaze pod konstitutivnim promotorjem, s čimer bi povečali pretvorbo naravno prisotne visoke vsebnosti piruvata v cianobakterijah v acetil-CoA in s tem povečali bioprodukcijo [1, 5].

Za zagotavljanje varnosti v primeru uhajanja mikroorganizmov v okolje bi zasnovali tudi stikalo za ubijanje (ang. killing switch). Slednji bi temeljil na logičnem vezju sestavljenem iz promotorja, ki se odziva na kovinske ione (PnrsB-BCD; promotor, ki se odziva na nikelj) in navzdol povezanem inhibitorjem nukleaze A (nuiA), ter konstitutivnim promotorjem in navzdol povezano nukleazo A. V zaprtem sistemu bi z dodatkom nikljevih ionov v gojišče zagotovili izražanje nuiA in s tem inhibicijo nukleazne aktivnosti, v primeru pobega cianobakterij v okolje, pa bi bilo izražanje nuiA ustavljeno in s tem omogočena nukleazna aktivnost, ki bi povzročila smrt cianobakterij [1].

Seznam uporabljenih komponent in oznake, ter povezave do delov v zbirki iGEM so dostopne na povezavi: https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/parts

Rezultati

Tekom projekta je ekipi uspelo testirati in dokazati delovanje naslednjega:

Izboljšanje intenzivnosti fluorescence z dodatkom LuxF in LuxG

Vlogo in učinek dodatka LuxF in LuxG v luminiscenčni sistem so preverili tako, da so transformirali bakterijski sev E. coli BL21[DE3] z dvema različnima plazmidoma; pET28a-luxCDABE in pET28a-luxCDABEGF, ki se razlikujeta po vsebnosti genov luxF in luxG, ter primerjali fluorescenco celic po z IPTG induciranem izražanju. Plazmida so skonstruirali z metodo sestavljanja po Gibsonu (ang. Gibson assembly), fluorescenco pa so opazovali in primerjali s prostim očesom in z merjenjem fluorescence na bralniku plošč (ang. plate reader). Rezultati so pokazali, da dodatek omenjenih proteinov res izboljša intenzivnost fluorescence. Razlika v intenziteti je bila opazna že s prostim očesom, meritve fluorescence pa so pokazale povečanje intenzitete svetlobe za kar 58 % [1].

Dokaz učinkovitosti metode BRET

Delovanje metode BRET so preverili s sintezo novega fuzijskega fluorescenčnega proteina LuxB:cp157Venus. Slednjega so pripravili tako, da so na C-konec gena luxB dodali povezovalec (Glu-Leu) in zapis za rumeni fluorescenčni protein cp157Venus. Pripravili so plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus in plazmid pET-28a_lacO-LuxA-LuxB brez fuzijskega proteina za kontrolo in primerjavo. Konstrukcija plazmida je potekala z isto metodo kot v točki 1), prav tako izražanje. Pred izražanjem proteinov so plazmida še pomnožili v bakterijskem sevu DH5α. Rezultati so pokazali, da so celice transformirane s kontrolnim plazmidom oddajale svetlobo, medtem ko celice transformirane s plazmidom pET-28a_lacO-LuxA-LuxB:cp157Venus niso svetile. Poskus so ponovili z uporabo dveh drugih fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali v bazi podatkov FPbase (poimenovana A1 in A2), ter dveh fluorescenčnih proteinov, ki so ju poiskali s pomočjo modela LSTM (Long Short-Term Memory Networks), ki so ga oblikovali in vzpostavili sami (poimenovana B1 in B2). V tem primeru so za pozitivno kontrolo uporabili pET28a-luxCDABEGF. Eksperiment je uspel in celice s testiranimi proteini so fluorescirale v različnih barvah, intenziteta slednjih pa je bila slabša od intenzitete kontrolne skupine, kar je bila posledica uporabe neustreznega povezovalca [1].

Transformacija cianobakterij in preverjanje obnašanja promotorja z ritmičnim izhodom - PkaiBC

Uspelo jim je preveriti tudi delovanje promotorja PkaiBC in integrirati operonski sistem lux CDABEFG v genom cianobakterij. Tega so se lotili tako, da so najprej pripravili rekombinantni plazmid pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1, ki vsebuje želeni promotor in fluorescenčni protein sfGFP, ter nato še enako sestavljen plazmid z luxCDABEFG. Prvega so pripravili zaradi enostavnosti preverjanja delovanja sistema (opazovanje fluorescence pod mikroskopom). Plazmida so z naravno transformacijo vstavili v cianobakterije (inkubacija mešanice plazmida in kulture v temi), ter kulturo nacepili na agarske plošče s kanamicinom. Uspešnost vnosa plazmida in integracije genov v genom so preverili s PCR na osnovi kolonije in z opazovanjem celic pod fluorescenčnim mikroskopom. Cianobakterije transformirane s pUC57_NS3-2-PKaiBC-sfGFP-lacI-KanR-NS3-1 so pod mikroskopom pokazale očitno zeleno fluorescenco, na AGE pa so dobili lise ustreznih velikosti. Za nadaljnjo karakterizacijo jim je žal zmanjkalo časa [1].

Viri

1. ShanghaiTech-China - iGEM 2023. Pridobljeno 6. maj 2024, s https://2023.igem.wiki/shanghaitech-china/index.html
2. Brodl, Eveline et al. “The impact of LuxF on light intensity in bacterial bioluminescence.” Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology vol. 207 (2020): 111881. doi:10.1016/j.jphotobiol.2020.111881
3. Nijvipakul, Sarayut et al. “LuxG is a functioning flavin reductase for bacterial luminescence.” Journal of bacteriology vol. 190,5 (2008): 1531-8. doi:10.1128/JB.01660-07
4. Li, S., Sun, T., Chen, L., and Zhang, W. (2021). Designing and Constructing Artificial Small RNAs for Gene Regulation and Carbon Flux Redirection in Photosynthetic Cyanobacteria. Methods Mol Biol 2290, 229-252.
5. Hirokawa Y, Kubo T, Soma Y, Saruta F, Hanai T. Enhancement of acetyl-CoA flux for photosynthetic chemical production by pyruvate dehydrogenase complex overexpression in Synechococcus elongatus PCC 7942. Metab Eng. 2020 Jan;57:23-30. doi: 10.1016/j.ymben.2019.07.012. Epub 2019 Aug 1. PMID: 31377410.