Vloga plazmidov pri virulenčnosti klamidij

Uvod

Chlamydia trachomatis je bakterija, ki povzroča različne okužbe na sluzničnih mestih pri ljudeh, vključno z očesno konjunktivo, genitalnim in prebavnim traktom ter dihalnim traktom novorojenčkov. Okužba očesa lahko povzroči resne posledice, kot so brazgotinjenje in notranje zasukane veke, kar lahko privede do slepote. C. trachomatis serovarji A-C so vodilni povzročitelji infekcijske slepote po svetu, zaradi česar je trachoma pomemben javnozdravstveni problem, ki je prizadel približno 1,9 milijona ljudi.

Okužba reproduktivnega trakta, ki jo povzročajo serovarji D-K in L1-L3, je najpogostejša bakterijska spolno prenosljiva okužba povsod po svetu. Pri ženskah se začne v endocerviksu in se lahko vzpenja po reproduktivnem traktu, kar lahko privede do resnih zapletov, kot je medenično vnetna bolezen, in dolgoročne posledice, kot sta neplodnost ali zunajmaternična nosečnost.

Nedavne študije so pokazale, da se serotip C. trachomatis D-K lahko izolira tudi iz rektuma moških in žensk, kjer lahko deluje kot simbiont s črevesno floro. Čeprav rektalna okužba običajno ne povzroča lokalnih vnetnih simptomov, je bila pri nekaterih novorojenčkih, ki so bili navpično okuženi od matere, opažena spontana resolucija okužbe v enem letu. Kar kaže ,da rektalne okužbe ne vodijo do obolenja.

Bi-fazni razvoj bakterij C. trachomatis

Bakterija C. trachomatis je gram-negativna intracelularna bakterija z bi-faznim razvojnim ciklom, ki vključuje infektivna elementarna telesa (EB) in replikativna retikularna telesa (RB). Bi-fazni razvoj klamidije se začne s prvo fazo, ki vključuje vezavo infektivnih elementarnih teles (EB) na površino gostiteljskih celic, s pomočjo bakterijskih proteinov in gostiteljskih receptorjev .Ta proces se sproži s tvorbo trimolekularnega mostu med bakterijskimi adhezini, gostiteljskimi receptorji in heparan sulfatnimi proteoglikani (HSPG). To omogoča EB-jem, da se pritrdijo na površino celice in se nato endocitozirajo v membransko vezan kompartiment, znan kot inkluzija.

V tej fazi je ključnega pomena prenos pred-sintetiziranih efektorjev, kot so Tarp, TepP, CT694, CT695 in TmeA, v citosol gostiteljske celice preko tip III sekrecijskega sistema (T3SS). Ti efektorji spodbujajo preurejanje citoskeleta, kar olajšuje notranje usmerjanje EB-jev in/ali sproži mitogeni signal, ki vzpostavi antiapoptotično stanje v gostiteljski celici.

Ko so EB-ji v inkluziji, se začne druga faza razvojnega cikla, ki vključuje njihovo diferenciacijo v replikativna retikularna telesa (RB). Med to fazo se retikularna telesa eksponentno razmnožujejo in izločajo dodatne efektorje, ki modulirajo procese v gostiteljski celici. Poleg tega lahko retikularna telesa v primeru stresa preidejo v stanje vztrajnosti, kjer preidejo v povečana nenormalna telesa. Ta adaptacija omogoča bakterijam preživetje pod neprijaznimi pogoji, in ko je stres odstranjen, se lahko retikularna telesa ponovno aktivirajo.

Med pozno fazo okužbe retikularna telesa nadaljujejo z izločanjem efektorjev, ki so značilni za pozno fazo cikla, in sintetizirajo efektorje, specifične za elementarna telesa, preden se diferencirajo nazaj v EB-je. Končna faza razvojnega cikla je, ko se RB asinhrono spreminjajo nazaj v EB-je. V tej fazi so ključni mehanizmi izločanja, kot je liza celice ali ekstruzija, ki omogočajo sproščanje EB-jev iz okužene celice. Sproščeni EB-ji lahko nato ponovno sprožijo razvojni cikel z vezavo na sosednje gostiteljske celice, s čimer se okužba širi na nove celice in olajšuje širjenje klamidije v gostitelju.

Imunski odziv na okužbo s klamidijo

Okužene epitelne celice prepoznajo klamidije preko receptorjev za prepoznavanje vzorcev (PRR-ji) na in v gostiteljski celici. Do sedaj je bilo dokazano, da klamidije aktivirajo cGAS, STING, NOD1, kaspazo-11, TLR2, in TLR4, od teh kaspaza-11 in TLR2 prispevata k imunopatologiji. Klamidije aktivirajo inflamazom kaspaze-11 pri miših, verjetno s lipopolisaharidom. Ljudje izražamo kaspazo-4 in kaspazo-5 namesto kaspaze-11, kar otežuje neposredne primerjave med mišjim modelom in človeško boleznijo.

Klamidije prav tako aktivirajo TLR2, izražen na celični in endosomski membrani več tipov celic, vključno z epitelnimi in imunskimi celicami. Bakterijski lipoproteini in polisaharidi aktivirajo TLR2 v drugih modelih okužb, vendar klamidijski ligand za TLR2 ostaja neidentificiran. TLR2 in njegov adapterski protein MYD88 se lokalizirata v klamidijski inkluziji med okužbo. Ko je aktiviran, TLR2 pridobi MYD88 in sproži signalno kaskado, ki na koncu aktivira transkripcijske faktorje NFκB in/ali AP-1 preko aktivacije MAP-kinaz (MAPK). Aktivacija NFκB in/ali AP-1 vodi v produkcijo in izločanje citokinov, kot so TNF-α, IL-6 in IL-8.

Študije so pokazale, da so nevtrofilci primarne celice, ki povzročajo tkivno škodo med okužbo. Pri miših intenzivno privabljanje in aktivacija nevtrofilcev v jajcevodih povzročata brazgotinjenje in kasnejšo post-obstrukcijsko dilatacijo. Predvidevajo, da je patologija, povezana z nevtrofilci, rezultat več mehanizmov, vključno s fizičnim izpodrivanjem celic iz epitelija in produkcijo proteinov, ki poškodujejo tkivo, kot je metaloproteaza matriksa-9 (MMP-9). Za čiščenje bakterij je potreben prilagodljiv imunski odziv, ki ga zaznamuje sodelovanje med protitelesi, CD4 + T celicami in fagociti. Specifični mehanizmi, ki bi razlikovali med imunskim odzivom na klamidijsko okužbo v prebavnem traktu od odzivov v očesu ali reproduktivnem traktu, trenutno niso znani.

Izguba klamidijskega plazmida je pleiotropna

O pleiotropiji govorimo, ko en gen vpliva na dva navidezno nesorodna fenotipa. Takšen gen je pleiotropen. Številne vrste klamidij, vključno s C. trachomatis in C. muridarum, vsebujejo ohranjen plazmid velikosti 7,5 kbp. Klamidijski plazmid je skoraj povsod prisoten med kliničnimi izolati C. trachomatis, opisani pa so le redki primeri sevov brez plazmida.

Izolacija sevov C. trachomatis, ki so spontano izgubili plazmid in odstranjevanje klamidijskega plazmida z novobiocinom iz C. muridarum sta zagotovila nekaj prvih jasnih dokazov, da je izguba plazmida pri klamidiji pleiotropna. Klamidije brez plazmidov kažejo zmanjšano kužnost, sprožijo zmanjšane ravni vnetja in patologije ter ne kopičijo glikogena v svojih inkluzijah.

Mehanizmi, ki potekajo pri okvari infektivnosti, povezane s plazmidom, ostajajo neznani. Kasneje so izolirali spontane supresorje tega fenotipa. Dokazali so, da eden od teh mutantov, sev CM3.1, ni zaostajal v konkurenci s svojim prednikom (ki vsebuje plazmid) med zaporednimi pasažami celic in se učinkovito dvigal do zgornjega genitalnega trakta miši. Sekvenciranje celotnega genoma mutanta je pokazalo polimorfizem posameznega nukleotida, ki naj bi prehitro prekinil izražanje proteina TC_236, katerega funkcija ni znana.

Fagocitne dendritične celice iz mišjega kostnega mozga, inkubirane z mutanti brez plazmida, proizvajajo manj TNF-α in IL-6 kot celice, inkubirane z divjimi sevi. Podobno človeške epitelne celice, okužene s C. trachomatis brez plazmida s centrifugiranjem, izločajo manj GM-CSF, IL-6 in IL-8 kot okužene celice divjega tipa.

Okužba genitalnega trakta miši z divjim sevom C. muridarum prav tako vodi v okužbo prebavnega trakta, predvsem slepiča in debelega črevesa. Pomembno je, da se C. muridarum sistemsko razširja pri miših, kar zagotavlja dodatno, hematogeno pot širjenja iz genitalnega trakta v prebavni trakt. Nasprotno pa ostanejo genitalni serotipi C. trachomatis pri ljudeh omejeni na sluznico.

Fagocitne dendritične celice iz mišjega kostnega mozga, inkubirane z mutanti brez plazmida, proizvajajo manj TNF-α in IL-6 kot celice, inkubirane z divjimi sevi. Nižje ravni izločanja od TLR2 odvisnih citokinov pri miših, okuženih z CM3.1, so povezane z manjšim privabljanjem nevtrofilcev v jajcevodih, vendar rekrutacija prilagodljivih CD4+ T celic ostaja nespremenjena. Aktivacija HEK-TLR2-poročevalskih celic z živimi in z UV-inaktiviranimi bakterijami divjega tipa (medtem ko mutanti brez plazmida ne aktivirajo) zagotavlja neposredne dokaze za od plazmida odvisno aktivacijo TLR2, neodvisno od klamidijske rasti in replikacije.

Študije okužbe makakov z divjim tipom in mutiranim sevom C. trachomatis niso pokazale nobenih razlik v patologiji. Vpliv na patologijo je imelo izražanje CD4+ T celic. Tiste opice, ki so imele to izražanje povečano, so kazale višjo odpornost, kot tiste z zmanjšanim izražanjem teh celic in povečanimi titri protiteles. Te razlike niso bile povezane s prisotnostjo ali odsotnostjo plazmida in nasprotujejo jasni povezavi med prenašanjem plazmida in podaljšano kužnostjo, ki so jo pokazale študije.

Virulenca in vpliv plazmida na okužbe s C. trachomatis

Chlamydia trachomatis je intracelularni patogen, ki lahko povzroči različne bolezni pri ljudeh. Med najpogostejšimi so okužbe očesa, spolno prenosljive okužbe in vnetne bolezni genitalnega in prebavnega trakta. Pomembno je razumeti virulentne lastnosti te bakterije, še posebej v luči vloge plazmida C. trachomatis pri virulenci in patologiji po okužbi.

Plazmid C. trachomatis je ključen za virulenco in patologijo po okužbi. Študije kažejo, da je prisoten pri večini kliničnih izolatov, kar nakazuje na aktivno izbiro plazmida med evolucijo. Vloga plazmida pri virulenci ostaja tema debate, še posebej v povezavi z različnimi tkivi in specifičnimi vrstami bakterije. Opazili so razlike med tkivi glede vnetnega odziva, ki je odvisen od plazmida, kar kaže na tkivno-specifične učinke interakcij C. trachomatis s gostiteljskimi mehanizmi.

Povezava plazmidnih genov pgp3 in pgp4 z virulenčnostjo

Plazmid klamidije kodira 8 odprtih bralnih okvirov (pgp1-pgp8) in 2 nekodirajoči RNA molekuli, ki igrata pomembno vlogo v delitvenem ciklu. Odprti bralni okviri pgp1, -2, -6 in -8 kodirajo proteine, pomembne za plazmidno replikacijo in vzdrževanje. Pgp4 je domnevni regulator transkripcije, ki je potreben za izražanje gena pgp3 in kromosomskih lokusov, med tem tudi gena glgA, ki kodira glikogen sintazo.

Pgp3 je trimerni protein, ki se sprosti v citosol gostitelja ob okužbi. Pgp5 kodira domnevni transkripcijski regulator, ki negativno regulira plazmidno regulirane kromosomske lokuse. Od osmih bralnih okvirov na plazmidu klamidije so bili pgp3, pgp4 in pgp5 povezani z virulenčnostjo in okužbo. Dvojna delecija v genih pgp3 in pgp4 pri relativno zgodnji pasaži bakterij seva C. trachomatis je povzročila defekt v njeni infektivnosti tako v celični kulturi kot tudi v modelu genitalnega trakta miši. Delecija enega od genov pgp3 ali pgp4 vodi v napako neučinkovitosti pri vrstah C.muridarum in C.trachomatis pri okužbi genitalnega trakta miši. Prav tako se upočasni širjenje C.muridarum iz genitalnega trakta v prebavila.

Intravaginalana infekcija z mutiranim sevom C. muridarum, ki nima Pgp3 ali Pgp4 zmanjša patologijo jajcevoda pri miših. Delecijo pgp5 so povezali z zmanjšanim širjenjem proti jajcevodu ter zmanjšano pogostostjo pojava hydrosalpinxa v primerjavi z okužbo z divjim tipom. Ti rezultati ukazujejo na to, da so Pgp3, Pgp4 in Pgp5 močno povezani z virulenčnostjo klamidij.

Mehanizem Pgp3 pri klamidijski virulenčnosti in vnetju med okužbo

Pgp3 je unikatni trimerni protein, ki nima homologov na ravni primarne strukture. Je zelo dobro ohranjen znotraj sevov Chlamydia spp., in sicer kar z več kot 96% homolognostjo znotraj serotipov C. Trachomatis in z 82% homolognostjo med sevoma C. trachomatis in C. muridarum. Pgp3 je imunodominanten, kar pomeni, da med okužbo s klamidijo se pri 70% okužencev razvijejo protitelesa proti Pgp3. Imunodominanca Pgp3 najverjetneje izvira iz izločanja tega proteina tekom okužbe. Pgp3 se izloči v citosol okužene gostiteljske celice pozno med ciklom okužbe proti koncu replikacije in med pretvorbo retikularnih telesc v elementarna.

Pgp3 se sprosti v citosol okužene epitelijske celice ob celični lizi ter se veže na protimikrobni peptid LL-37 (pri ljudeh) ter CMAP (pri miših) v zunajceličnem matriksu, da zaustavi prepričitev širjenja klamidij. Vezava na antimikrobni peptid prav tako prispeva k spremembi imunskega odziva na Pgp3. Vezava Pgp3 na LL-37 upočasni kemotakso nevtrofilcev, ampak hkrati inducira izločanje citokinov iz nevtrofilcev in makrofagov. Sledeči mehanizem lahko prispeva k virulenčnosti in vnetju med okužbo genitalnega trakta, ampak ne razloži znižanja virulenčnosti in izločanja citokinov, ko so seve klamidij brez plazmidov gojili v celicah, ki niso proizvajale antimikrobnih peptidov.

Iz opažanj lahko zaključimo, da drugi lokusi, kodirani ali regulirani s plazmidom lahko sodelujejo pri plazmidni virulenčnosti. Še en predlog, ki sledi iz ugotovitev je, da ima Pgp3 več vlog pri virulenčnosti klamidij in vnetju. Mehanizem sekrecije Pgp3 je nejasen, vendar je ohranjen znotraj serotipov C. trachomatis in vrste C. muridarum.

Raziskava zunajceličnih membranskih veziklov je identificirala Pgp3 kot potencialni prenašalni protein. Imunofluorescenčno označevanje Pgp3 in Pgp4 je omogočilo določitev modela, v katerem se plazmidno regulirani efektorji izločijo skupaj z zunajceličnimi membranskimi vezikli, pri čem je sama sekrecija močno odvisna od Pgp4. Izločanje Pgp3 ne poteka brez prisotnosti Pgp4, zato lahko virulenčnost klamidij povežemo s sposobnostjo sekrecije Pgp3. Motnja sekrecijskega sistema, povezanega s plazmidom, ob izbrisu celotnega plazmida, gena pgp3 ali pgp4 zavira dogodke na membrani, ki prispevajo k tvorbi generacije optimalno virulenčnih elementarnih telesc.

Pgp3 naj bi lahko omogočal preživetje klamidije v kislem okolju, kot je želodec in genitalni trakt. Ugotovitev sledi iz raziskave, ki je dokazala preživetje celične kulture v želodčni in mlečni kislinah. Delecija Pgp3 v C. muridarum zmanjša sposobnost zasedanja genitalnega trakta v primerjavi z divjim tipom. Celice z okvarjenim genom pgp3 se izolirajo iz nižjega genitalnega trakta miši v manjšem številu, tako lahko sposobnost preživetja v želodčni kislini povežemo z odvisnostjo od izražanja Pgp3. Prejšnje študije so pa nasprotovale tem dokazom, in sicer menili so, da je defect v virulenčnosti povezan z genom pgp3v C. muridarum odvisen od bakterijskih ovir v zgornjem genitalnem traktu, ne pa spodnjem.

Spremembe v membrani, ki jih povzroči okvara gena pgp3, vodijo do povečane občutljivosti na kisline. Kljub temu kislinska toleranca ni glavni razlog za defekt pri virulenčnosti, ampak je zgolj ena od posledic v spremembi membranske strukture, ki se pojavi kot posledica pomanjkanja celotnega plazmida ali genov pgp3 in pgp4.

Pgp4 in Pgp5 v vlogi domnevnih regulatorjev virulenčnosti

Pgp4 je domnevni transkripcijski aktivator, saj je bila v celicah C. trachomatis, kjer je bil gen pgp4 izbrisan, opažena upočasnjena transkripcija gena pgp3 in PRCL (kromosomskih lokusov, reguliranih s plazmidom). Regulacija glikogen sintaze GlgA s Pgp4 prispeva k kopičenju glikogena v klamidijski inkluziji. Odsotnost Pgp4 in posledično upočasnjena transkripcija gena glgA v C. trachomatis brez plazmida onemogoči kopičenje glikogena. V vrsti C. muridarum pomanjkanje plazmida ne upočasni prepisovanja gena glgA, saj se ta prepisuje neodvisno od plazmida. Kljub prisotnosti aktivne glikogen sintaze, se glikogen ne nabira znotraj inkluzij. Pgp4 prav tako domnenvo sodeluje pri drugem mehanizmu izstopa iz celice, ki vsebuje sodelovanje z efektorjem CteG tipa III.

Pgp3 in PRCL kot CT049 in GlgA so izločeni v inkluzijo, oziroma kot v primeru Pgp3, se ta izloči v citosol gostiteljske celice. Omenjeni proteini se izločijo iz klamidije preko zunajceličnih membranskih veziklov, ki so tvorba zunanje membrane Gram-negativnih bakterij. Mehanizem za tvorbo veziklov ni v celoti preučen, vendar mora priti do razpada povezav med zunanjo membrano in peptidoglikanom. Tvoriti se morajo prenašalni proteinov v periplazmi, kar izboči zunanjo membrano. Lipidi v zunanji membrani se morajo premestiti, kar spremeni njeno obliko in fluidnost. Bakterije tvorijo zunajcelične membranske vezikle za usmerjanje gostiteljskih celic, imunski odziv, pridobivanje hranil in odstranjevanje toksičnih komponent. Funkcije veziklov so močno odvisne od vgrajenih prenašalnih proteinov in njihovo pakiranje je aktivno usmerjen proces.

Regulacija Pgp4 pri sekreciji veziklov poteka ne le na nivoju transkripcije prenašalnih proteinov, ampak domnevno sega tudi v področji pakiranja proteinov in izločanja veziklov. Produkcija in izločanje zunajceličnih membranskih veziklov ni v celoti odvisna od plazmidov, saj je dobro ohranjena med mnogimi Gram-negativnimi bakterijami. Najbolj verjetno je bil mehanizem izkoriščen s strani klamidijskega plazmida kot pot za izločanje efektorjev virulenčnosti.

Pgp5 je negativni transkripcijski regulator. V primeru delecije gena pgp5 ni prišlo do spremembe v ekspresiji gena 'pgp3', iz česar lahko zaključimo da lahko Pgp5 regulira le del genov, ki so v večini odvisni od Pgp4. Funkcija Pgp5 je ohranjena med vrstama C.muridarum in C.trachomatis, kar je bilo dokazano z zamenjavo gena pgp5 z njegovim homologom iz druge vrste, pri čemer se je ohranila transkripcijska regulacija, odvisna pd Pgp5. Transkripcijska represija s Pgp5 je bolj učinkovita z izoliranim Pgp5 iz C. muridarum. Iz tega lahko sklepamo, da so kromosomski lokusi, regulirani s plazmidom, bolj tesno regulirani znotraj vrste C. muridarum, kot C. trachomatis. Delecija gena pgp5 se odraža v manjši celični infiltraciji in izločanju citokinov.

Zaključek

Klamidijski plazmid je ključen za virulenco in patologijo po okužbi ter vzdrževanje kolonij v prebavilih miši. Raziskovalci so opazili tkivno-specifične razlike v vlogi plazmida, kjer pomanjkanje plazmida v spolnem traktu miši zmanjša vnetje, medtem ko klamidije s plazmidom v prebavilih ne povzročijo vnetja. Opazili so tudi različne vloge plazmida med C. trachomatis in C. muridarum, pri čemer plazmidna odvisna aktivacija TLR2 vodi do različnih izidov okužbe v različnih tkivih. Aktivacija TLR2 lahko sproži vnetni odziv, ki prispeva k tkivni poškodbi in patologiji, na primer v genitalnem traktu miši. Razlike v intenzivnosti in naravi vnetnega odziva so bile opažene med različnimi sevi C. trachomatis in C. muridarum. Plazmidna virulenca je povezana s proteinskimi virulentnimi dejavniki, kot so Pgp3, Pgp4 in Pgp5. Te proteine so identificirali kot ključne akterje pri modulaciji infektivnosti in vnetnega odziva gostitelja. Razumevanje mehanizmov, preko katerih ti proteini vplivajo na infektivnost in vnetje, ostaja izzivno, saj noben posamezen mehanizem ne pojasnjuje vseh opazovanih pojavov.

Viri

Turman, B. J., Darville, T., & O’Connell, C. M. (2023). Plasmid-mediated virulence in Chlamydia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 13. https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1251135

Liu, Y., Huang, Y., Yang, Z., Sun, Y., Gong, S., Hou, S., Chen, C., Li, Z., Liu, Q., Wu, Y., Baseman, J. B., & Zhong, G. (2014). Plasmid-Encoded Pgp3 Is a Major Virulence Factor for Chlamydia muridarum To Induce Hydrosalpinx in Mice. Infection and Immunity, 82(12), 5327–5335. https://doi.org/10.1128/iai.02576-14

Hou, S., Dong, X., Yang, Z., Li, Z., Liu, Q., & Zhong, G. (2015). Chlamydial Plasmid-Encoded virulence factor PGP3 neutralizes the antichlamydial activity of human cathelicidin LL-37. Infection and Immunity, 83(12), 4701–4709. https://doi.org/10.1128/iai.00746-15

Elwell, C. A., Mirrashidi, K. M., & Engel, J. N. (2016). Chlamydia cell biology and pathogenesis. Nature Reviews. Microbiology, 14(6), 385–400. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.30