Metoda TASER za detekijo nukleinskih kislin

METODA TASER ZA DETEKCIJO NUKLEINSKIH KISLIN

Metode za določanje prisotnost specifičnih nukleinskih kislin je veliko. Od klasičnega PCR do različnih izboljšanih in modificiranih metod kot so LAMP (ang.loop-mediated isothermal amplification), RPA (ang. recombinase polymerase amplificatons), HBA (ang.hybridization chain reaction) imamo različnih na voljo[1][2]. Vendar, pogosto te metode zahtevajo določene pogoje in specifične reagente, ki nam niso dostopni. Zato so v tem članku razvili novo metodo. TASER, kar pomeni "usmerjena sinteza reporterskih encimov" (ang. Target-Assisted Synthesis of Enzyme Reporters), je inovativna metoda za detekcijo nukleinskih kislin, ki izkorišča proces translacije za zaznavanje prisotnosti specifičnih nukleotidnih zaporedij in omogoča visoko občutljivo in natančno zaznavanje istih. Encimi, ki se sintetizirajo, se potem izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami kot so fluorimetrija, spektrofotometrija itd. Jakost signala proteinov je sorazmeren s prisotnostjo specifičnega nukleotidnega zaporedja. Metoda ima več prednosti pred klasično PCR metodo za zaznavanje nukleotidnih zaporedij, med katerimi je najpomembnejša, da ni potrebe po dodatni opremi in je lahko izvedljiva v različnih okoljih[1][3][4].

Postopek metode TASER

Prednost detekcije proteinov pred nukleinskimi kislinami so lastnosti proteinov, ki se lahko izkoriščajo na različne načine za detekcijo. Lahko merimo optične, električne, immunološke itd. Za izvedbo metode so dizajnirali mehanizem, ki so ga poimenovali molekularni pretvornik in je zadolžen za pretvorbo nukleinskih kislin v željeni reporterski protein ali encim, odvisno od metode detekcije. Sestavljen je iz senzor-DNA (v nadaljevanju sDNA) in kompleks za sintezo proteinov, ki deluje v brezceličnem okolju. sDNA vsebuje del, ki je komplementaren tarčnemu zaporedju. Ko se sDNA poveže s tarčnim zaporedjem, se začne sinteza reporterskega encima ali proteina. S tem lahko zaznamo tudi najmanjšo prisotnost nekega zaporedja[1].

Priprava sDNA

Da bi prišlo do sinteze nekega reporteskega encima, moramo imeti še njegov zapis. Ta zapis je del sDNA. sDNA lahko zapisuje za slednje proteine: sfGFP (dodatno zvit zeleni fluorescenčni protein), bakterijska invertaza, β-galaktozidaza iz E.coli, nukleokapsidni protein virusa pasje kuge in NLuc. Reporterski gen je pod kontrolo promotorja T7. Mesto (TBS) kamor se tarča veže se nahaja navzgor od promotorja. Posebnost sDNA je, da je del, na katerem se nahaja zapis za protein dvoverižen, medtem ko je TBS in promotor enoverižen. Zgoraj omenjene proteine so klonirali v pK7 plazmidu, kateremu so predhodno izrezali T7 promotor. Nato so bili zapisi za proteine pomnoženi s PCR, pri katerem so uporabili začetne oligonukleotide, ki so bili bogati z uracilom. Po pomnoževanju so uporabili USER encim, s katerim so odstranili uracile in izpostavili enoverižni del sDNA, kjer se nahajata zapisa za TBS in T7 promotor[1].

Potek reakcije TASER

V reakcijsko mešanico so dodali ustrezne količine tarčne DNA in sDNA pri 30 mM HEPES, pH 7.5 in 100 mM kalijevega acetata. Mešanico so segreli na 95°C za 5 min in nato pustili, da se ohladi pri sobni temperaturi, da pride do povezovanje tarčne DNA s sDNA. Nato so odvzeli 3 µL te raztopine in dodali k že pripravljeni mešanici, ki je vsebovala naslednje stvari: 57 mM HEPES–KOH (pH 7.5), 1.2 mM ATP, 0.85 mM CTP, GTP in UTP, 2 mM DL-ditiotreitol, 0.17 mg/mL E. coli tRNA MRE600, 0.64 mM cAMP, 90 mM kalijev glutamat, 80 mM amonijev acetat, 12 mM magnezijev acetat, 34 μg/mL l-5-formil-5,6,7,8- 138 tetrahidrofolična kislina, 1.5 mM vsake izmed 20 aminokislin, 67 mM kreatin fosfat, 3.2 μg/mL kreatin kinaza, 0.2 U/μL E. coli DNA polimeraza I, 0.25 mM dNTPji. Mešanico so inkubirali pri 30°C za 30 min[1].

Detekcija signala

V odvisnosti od reporterskega encima so uporabili različne metode za določanje signala. Pri sfGFP so merili fluorescenco proteina, pri NLuc so merili luminiscenco, za β-galaktozidazo so uporabili kolorimtrične metode in pri bakterijski invertazi so merili ravni glukoze.V 30 mL reakcijski mešanici je iz 150 fmol matrične DNA nastalo okrog 1.2 mg/mL sfGFP. Ojačitev signala je bila ocenjena na 10000 kopij proteina iz ene kopije gena[1][5].

Izboljšanje sDNA

Pripravili so nekoliko začetnih oligonukleotidov različne dolžine, ki se vežejo na enoverižni del sDNA. Cilj je bil testirati, koliko bo močna translacija. sDNA sama po sebi, brez vezave tarčne molekule, ni sposobna aktivirati translacije. Za transkripcijo s T7 RNA polimerazo je nujno potrebno, da je promotor dvoverižen. Njihovi poskusi so pokazali, da je bila sinteza sfGFP večja, ko je bil začetni oligonuleotid daljši. Rezultat je posledica večje stabilnosti dvoverižne DNA, ko je več baznih parov[6].

Delovanje molekulskega pretvornika

Preizkusili so delovanje sDNA z različnimi zaporedji. Želeli so ugotoviti, katera je najmanjša dolžina dvoverižnega promotorja, da lahko trankripcija poteče. In vitro poskus je pokazal, da transkripcija ne poteče, če je manj kot 7 baznih parov na 5’ koncu promotorja. Za najbolj optimalen rezultat je potrebno, da je na promotorju 13 nukleotidov, ki so njemu komplementarni. Zanimiv rezultat so dobili pri poskusu z ekstraktom E.coli S12. Ta ekstrakt vsebuje večino celičnh encimov, kar je privedlo do sinteze reporterskih encimov, tudi takrat, ko je bila dolžina dvoverižnega promotorja manjša od minimalne, potrebna za transkripcijo. To so pripisai temu, da se je DNA Pol I prepoznala kratko zaporedje nukleotidov kot začetni oligonukleotid in podaljšala verigo. Posledično so se odločili, da bi pri izvedbi metode TASER, reakcijsko mešanico obogatili z ekstraktom iz E.coli S12. Intenziteta fluorescence sfGFP pri merjenju signala je bila za 180% večja od tiste brez ekstrakta. Zaporedje navzgor od T7 promotorja se lahko izkoristi kot TBS, če ustreza z iskano tarčo[1].

Izboljšave za občutljivejše zaznavanje univerzalnih tarč

Da bi se izognili pripravam novih sDNA za vsako tarčo, so uvedli endonukleazo FEN1. FEN1 cepi viseče konce, ki se nahajajo na stiku med enoverižno in dvoverižno DNA. Tako bi pripravili dve sondi. Ena sonda bo imela del, ki je komplementaren tarčni DNA in en previs, ki je komplementaren enoverižnemu zaporedju na sDNA. Druga sonda je brez previsov. Tako se tvori substrat, ki ga FEN1 lahko cepi. Dodamo večjo količino sonde kot imamo tarčno DNA. To bo povzročilo, da se pri vsaki cepitvi, sonda zamenja z drugo necepljeno. Cepljeni previs bi se nato vezal na sDNA in aktiviral translacijo. Tako dosežemo večjo sintezo reporterskega encima in ojačitev signala. S tem se tudi izognemo ponovni pripravi sDNA, če iščemo drugo tarčno DNA. V takšnem primeru je potrebna samo priprava drugačnih sond, kar je lažje od priprave nove sDNA[1][7]. Pomankljivost je, da se lahko pojavi močan signal v ozadju. Izvor tega šuma je povezovanje necepljenega previsnega konca s sDNA. Eksonukleazna aktivnost Pol I odstrani previs. Posledično pride do lažnega poztivnega signala. Zato so uvedli fosforotioante vezi pri sondah, katerih Pol I ne more cepiti in se je s tem lažno pozitiven singal zmanjšal. Meje detekcije se gibljejo med femtomolno in picomolno koncenracijo tarčne DNA. Optimalen čas trajanja reakcije glede na razmerje signal/šum je 2 uri[1][7].

Prednosti in uporaba metode TASER

Metoda TASER prinaša več pomembnih prednosti. TASER je visoko specifična zaradi uporabe specifičnih sond za prepoznavanje tarčnih nukleinskih kislin in je možnost napačnih pozitivnih rezultatov zmanjšana. Je tudi izjemno občutljiva. Encimska ojačitev omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij tarčnih nukleinskih kislin, kar je ključno za zgodnje odkrivanje bolezni ali drugih bioloških markerjev. Velika prednost je tudi večnamenskost. Metoda je prilagodljiva in se lahko uporablja za različne vrste nukleinskih kislin[1][3].

Uporabljamo jo pri klinični diagnostiki za hitro in natančno zaznavanje patogenov, genetskih mutacij in drugih biomarkerjev in pri okoljskem monitoringu za zaznavanje specifičnih mikroorganizmov ali genetskih markerjev v okoljskih vzorcih, kot so voda, tla ali zrak, kar je pomembno za spremljanje onesnaženja in ekoloških študij[1][3].

Zaključek

Ta študija predstavlja novo metodo za zaznavanje nukleinskih kislin s pretvorbo teh v enostavno kvantifikativne encime. Pristop uporablja brezcelični sistem za sintezo proteinov, ki so usklajeni s specifičnimi tarčnimi zaporedji nukleinskih kislin. Lastnosti teh reporterskih proteinov oz encimov se nato izkoriščajo za detekcijo z različnimi metodami. V tem članku so preizkusili različne načine delovanja sDNA, kako dolga mora biti, kako se lahko izboljša in kakšne so njene pomankljivosti. Metoda se sooča z izzivi, kot so nadzor temperature in občutljivost. Potrebne so nadaljnje študije za reševanje teh težav, vključno z inženiringom FEN1, izboljšanjem pogojev testa in razvojem bolj odzivnih reporterskih encimov. Ta pristop ponuja večjo enostavnost uporabe, veliko občutljivost in prilagodljivost, še posebej v različnih zahtevnih diagnostičnih okoljih.

Viri

[1] Y. J. Park, D. Song, D. Kim, TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter, Sensors and Actuators B: Chemical, Volume 400, Part B (2024).

[2] J. Compton, Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350 (1991), pp. 91-92.

[3] M.J. Broadhurst, T.J. Brooks, N.R. Pollock, Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future, Clin. Microbiol. Rev. 29 (2016) 773–793.

[4] N.K. Krishna, K.M. Cunnion, Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease emergencies, Med. Clin. North Am. 96 (2012) 1067–1078.

[5] M. Merkx, B. Smith, M.C. Jewett, Engineering sensor proteins, ACS Sens., 4 (2019), pp. 3089-3091.

[6] A. Ujvári, C.T. Martin, Identification of a minimal binding element within the T7 RNA polymerase promoter J. Mol. Biol., 273 (1997), pp. 775-781.

[7] V.I. Lyamichev, M.W. Kaiser, N.E. Lyamicheva, A.V. Vologodskii, J.G. Hall, W.P. Ma, et al., Experimental and theoretical analysis of the invasive signal amplification reaction Biochemistry, 39 (2000), pp. 9523-9532.