OrthologTransformer

Izhodiščni članek Cross-species gene redesign leveraging ortholog information and generative modeling.

Uvod

Heterologna genska ekspresija - izražanje genov v tujih organizmih omogoča proizvodnjo proteinov v bolj uporabniku prijaznim ekspresijskih sistemih. Pri tem se pojavi nekaj problemov: organizmi imajo drugačno preferenco za kodone, zaradi česar pred takšnim postopkom izvedemo optimizacijo rabe kodonov. Glavna ovira je t.i. biološki kontekst, vsaka vrsta je namreč skozi evolucijo razvila svojevrstne preference v mehanizmih. Članek govori o tem, kako so raziskovalci naredili model, ki je sposoben preoblikovati nukleotidno zaporedje tako, da bo čim bolje delovalo v novem gostitelju, pri tem pa si algoritem dovoli tudi spreminjanje dizajna tudi na nivoju aminokislinskega zaporedja (deluje kot »prevajalnik« DNA sekvenc za prokarionte). Da bi to dosegli so model učili na ortolognih parih, iz katerih bi bilo možno model naučiti povezav med vrstama. Nato pa so pokazali, da model res izboljša heterologno ekspresijo na primeru PETaze iz I. Sakaiensis v E. Coli in okarakterizirali dobljen produkt.

Ortologi

Osrednja ideja članka je uporaba ortologov. Ortologi so geni v različnih vrstah, ki so se razvili iz skupnega predniškega gena. Ti geni običajno ohranjajo isto funkcijo, vendar so se njihova zaporedja skozi evolucijo prilagodila na specifične potrebe vrste. Narava je že opravila milijone poskusov optimizacije - vsako naravno zaporedje ortologa predstavlja "uspešno rešitev" za izražanje določenega proteina v določenem ekspresijskem sistemu. Če imamo na voljo na tisoče različnih zaporedij za isti protein v različnih organizmih, lahko z metodami strojnega učenja izluščimo skrita pravila, ki določajo, kako se zaporedje prilagodi okolju. Tradicionalne metode so ortologe uporabljale predvsem za iskanje ohranjenih (nespremenjenih) delov proteinov. Optimizacija implicira iskanje "najboljšega" stanja po nekem kriteriju (tukaj pogostost kodonov). Redizajn pa pomeni ustvarjanje novega, ustvarjenega naravnega zaporedja, ki upošteva celoten biološki kontekst gostitelja. Ta raziskava naredi ta korak: model uči, kako se deli, ki se spreminjajo (sinonimni kodoni), sistematično spreminjajo glede na vrsto. Tako napove medvrstni prenos, kjer model ugiba, kako bi bil tuj prokariontski gen zapisan, če bi se naravno razvil v bakteriji. To je ključno, ker model ne poskuša nujno maksimizirati hitrosti translacije, temveč poskuša predvideti ortolog, ki bi upošteval biološki kontekst. Izkazalo se je namreč, da so ortologna zaporedja pogosto "suboptimalna" v klasičnem smislu – vsebujejo lahko strateško postavljene počasne kodone, ki omogočajo proteinu, da se pravilno zvije.

Modeliranje

Avtorji so razvili model strojnega učenja, ki kot vhod vzame kodirajoče zaporedje in kot izhod vrne spremenjeno zaporedje. Uporabili so transformersko arhitekturo, da bi čim bolje zajeli kompleksnost odvisnosti med ortologi iz različnih vrst. Ortologi, ki so bili uporabljeni pri učenju modela so imeli ohranjeno funkcijo, zaradi česar bi se model mogel naučiti le sprememb, ki ohranijo funkcijo namesto motečih mutacij. Poleg tega so pri učenju na začetek zaporedja dodali še poseben token, ki je povedal iz katere vrste je sledeč zapis.

Rezultati

Testiranje modela

Teoretična zasnova generativnega modela, ki temelji na ortologih, je bila v raziskavi podvržena več preizkusom. Prvi je ocenil uspešnost napovedi ortolognih sekvenc. Raziskovalci so referenčne podatke razdelili na 2 zbirki podatkov: 1-1 ortologne pare med 2 vrstama (658 zaporedij) in več-več ortolognih povezav med 2138 vrstami (~4.9 miljonov sekvenc). Ugotovili so, da večja količina učnih podatkov močno izboljša natančnost napovedi: identičnost napovedi z pravim zaporedjem se je dvignila iz 0.15 za 2 vrsti na 0.4 za vseh 2138 vrst. Preverili so še, kako dobro njihov model deluje v primerjavi še s CodonTransformerjem, ki je relativo nov model za optimizacijo rabe kodona, ki deluje na podlagi sinonimnih mutacij. Pri tem so opazili, da so pri pretvorbah med organizmi, ki so se med seboj najbolj razlikovali, dobili največje izboljšave. Izbrali so še nekaj parov vrst in pri teh primerjali še delež GC in indeks adaptacije kodonov. Spremenjena zaporedja so se očitno spremenila v zaporedja bližja nativnim – delež GC se je očitno pomaknil proti tarčnem, indeks adaptacije kodona pa se približa distribuciji v nativnem organizmu. Dobljeni rezultati pokažejo jasne prednosti pred primerjanimi metodami iz česar je razvidno, da je za problem adaptacije na tuje gostitelje potrebno upoštevati več kot le sinonimno optimizacijo.

Testiranje izražanja PETaze

Testi modela so pokazali obetavne rezultate, zato so se znanstveniki odločili preveriti delovanje še in vivo. Odločili so se, da bodo PETazo iz Ideonella Sakaiensis (Gram negativna bakterija, ki raste počasi) izražali v Bacillus Subtilis. Za to so z modelom generirali 12 razlinih PETaz, s spreminjanjem podatkov, ki so jih uporabili za treniranje modela, in uporabe različnih metod dodatnega piljenja dobljenih rezultatov. Tako dobljene sekvence so nato izrazili v B. Subtilis in jih primerjali še z kontrolnimi sekvencami (wt sekvenco in sekvenco z optimizirano rabo kodona). Vsi konstrukti so vsebovali še N-terminalni signalni peptid za Sec pot, saj je PETaza encim, ki mora delovati v zunajceličnem okolju in oznako His za izolacijo. mRNA za konstrukt je bila izražena v vseh vzorcih, nivoji izražanja pa so se razlikovali med vzorci. V naslednji fazi so testirali ali se izraža protein: kulturo so centrifugirali in proteine supernantanta ločili na SDS PAGE gelu in nato prenesli na membrano z protitelesi proti His oznaki, na katera so nato vezali še sekundarna protitelesa s konjugirano alkalno fosfatazo. Po tem pa so dobljene protein preizkusili še z testom razgradnje PET. Kultura, ki proizvaja PETaze je bila inkubirana z filmom PET. Iz kulture so raziskovalci po določenih časovnih intervalih odvzeli alikvot in s HPLC preverili vsebnost razgradnih produktov reakcije (TPA, MHET, BHET). Ker je za PETazo znano, da ima endo aktivnost so se najbolj osredotočili na BHET, ki nastane kot posledica te vrste aktivnosti. Opazili so, da ena od variant deluje očitno bolje od ostalih in so za to posneli še sliko z vrstično elektronsko mikroskopijo PET filma po inkubaciji 7 dni, na katerem so opazne vdolbine približne velikosti celic, za razliko od kontrole, kjer je površina ostala gladka. To opažanje je še dodatno potrdilo, da sev L2 od vseh najbolje razgrajuje PET. S tem so uspešno pokazali, da je za delovanje PETaze in vivo pomembno mnogo faktorjev, med katerimi so tudi mRNA stabilnost in pogostost, prilagajanje rabe kodona z dodatnimi modifikacijami in druge, narejen model pa pri svojem delovanju najverjetneje optimizira več od teh. Da bi preverili splošno delovanje procesa so eksperiment ponovili še v E.Coli, pri čemer so ponovno dobili podobne rezultate, ki so bili nekoliko slabši le pri encimskem testu.

Razprava

Z učenjem na ortolognih parih se model nauči na katerih mestih evolucija dopusti sinonimne, kje podobne in kje občasne delecije ali insercije. To modelu omogoča zmožnosti, ki presegajo klasično optimizacijo rabe kodona. OrthologTransformer zato predstavlja pomemben napredek pri načrtovanju heterolognih genov. Konvencionalne metode prilagajajo uporabo kodonov, vendar inherentno zamrznejo proteinsko zaporedje, s čimer izpustijo primere, v katerih so spremembe na ravni proteinov koristne. Nasprotno pa OrthologTransformer izkorišča variacije med naravnimi ortologi za uvajanje evolucijsko vodenih aminokislinskih substitucij in majhnih indelov, kadar je to primerno. OrthologTransformer ne generira proteinov iz nič; deluje kot model zaporedja v zaporedje (seq2seq), ki pretvori obstoječe kodirajoče zaporedje v različico, optimizirano za tarčno vrsto. Z drugimi besedami, ob podanem kodirnem zaporedju DNA iz enega organizma izkorišča kontekst tega vhodnega zaporedja in znanje o ortolognih različicah, da ga prevede v zaporedje DNA, ki je primernejše za drug organizem. V primerjavi z drugimi pristopi strojnega učenja za načrtovanje genov je OrthologTransformer edinstven, ravno zaradi te možnosti uvajanja strateških aminokislinskih sprememb. Konceptualno je model široko uporaben: treniran je na večjem večvrstnem zboru ortologov, ki obsega na tisoče bakterijskih vrst in milijone parov ortologov, kar mu omogoča učenje splošnih vzorcev medvrstne prilagoditve genov. V študiji pa je bil OrthologTransformer treniran in potrjen na prokariotskih genih, tudi eksperimentalne demonstracije so omejene na bakterijske gostitelje. Razširitev tega pristopa na evkariotske sisteme bi zato zahtevala nadaljnje raziskave. Ker model deluje na kodirajočih zaporedjih, bi ga načeloma lahko uporabili za evkariotske gene z uporabo kodirajočih zaporedij z odstranjenimi introni. V praksi bo učinkovito načrtovanje evkariotskih genov verjetno povezano z ločeno optimizacijo promotorjev, regij UTR ter upoštevanjem alternativnega izrezovanja in izbire izoform. Ena praktična pot do evkariotskih aplikacij bi bila trening na evkariotskih parih ortologov brez intronov in uvedba dodatnih tokenov za kodiranje ključnih regulativnih značilnosti.

Zaključek

Če povzamem, znanstveniki so razvili celovit pristop k medvrstni prilagoditvi genov, ki presega omejitve tradicionalne optimizacije kodonov za prokariote. OrthologTransformer se uči iz rešitev narave - ortolognih genov, ki jih je evolucija optimizirala za različne organizme - in uravnoteži dvojno zahtevo po ohranjanju funkcije proteina in prilagajanju novemu kontekstu genoma gostitelja. Uspešna napoved in eksperimentalna validacija funkcionalnega ortologa PETaze za B. subtilis ponazarja moč tega pristopa. Za razliko od konvencionalnih metod, ki prilagajajo le uporabo kodonov, OrthologTransformer učinkovito preoblikuje gene tako, da so funkcionalno optimalno aktivni v novem gostitelju. Pričakujem, da bodo OrthologTransformer in podobne strategije načrtovanja ortologov imele široko uporabnost v sintezni biologiji - od omogočanja inovacij v bioindustrijski proizvodnji encimov do načrtovanja okoljskih rešitev.

Literatura

[1] Akiyama, M., Tashiro, M., Huang, Y. et al. Cross-species gene redesign leveraging ortholog information and generative modeling. Nat Commun 17, 2120 (2026).