Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
← Older edit
Primož Šenica Pavletič (talk | contribs)
100 edits
 
(16 intermediate revisions by the same user not shown)
Line 5: Line 5:
===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
===Sintezna biologija od spodaj navzgor===
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizíra in sprosti potomne fage.
V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.


===Namen raziskave===
===Namen raziskave===
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive celice, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti ali delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje molekule, encime, ribosome, aminokisline, nukleotide in energijske komponente, ki omogočajo transkripcijo in translacijo. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.
Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.


==Priprava sinteznih celic==
==Priprava sintetičnih celic==
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
===Zasnova membrane in uporaba RdLPS===
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. V tej raziskavi je bil kot receptorska komponenta uporabljen RdLPS, krajša oblika grobega LPS, ki vsebuje samo notranje jedro. Zaradi manjše velikosti in večje hidrofobnosti je primernejši za stabilno vključitev v lipidno membrano liposoma kot daljše oblike LPS.
Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.


Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanjem lističu membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.
Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.


Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: POPC, PE-PEG in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.
Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.


===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
===Preverjanje delovanja membrane z RdLPS===
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.
RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.


Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Pomembna ugotovitev je tudi, da prisotnost RdLPS v membrani ni zavrla delovanja celično-prostega sistema izražanja genov, CFE, v notranjosti liposomov. Aktivnost CFE sistema je bila potrjena z izražanjem reporterskega gena mcherry, ki povzroči rdečo fluorescenco.
Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.


Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil inženiran fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repna vlakna, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.
Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.


==Vstop in izražanje fagnega genoma==
==Vstop in izražanje fagnega genoma==
===Vstop genoma in izražanje mCherry===
===Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry===
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.
Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.


Vstop genoma je bil preverjen z inženiranima fagoma T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta vsebovala zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v sposobnosti vezave na RdLPS. T7-mC-S* je imel repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Logika poskusa je temeljila na tem, da se ob uspešnem vstopu fagnega genoma v liposomu začne izražati mCherry, kar povzroči rdečo fluorescenco.
Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.


Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.
Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.


===Vpliv MOI in velikosti liposomov===
===Neposredno spremljanje fagne DNA===
Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI, torej razmerja med številom infektivnih fagov in številom sintetičnih celic. Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic. Pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.
Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.


Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.
Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.


===Neposredno spremljanje fagne DNA===
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
==Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov==
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
===Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev===
Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.
Čas vstopa genoma so ocenili s primerjavo dveh pogojev: pri enem je bil fagni genom že v liposomu, pri drugem pa je moral vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescence je pokazala, da prenos genoma T7 traja približno 100–105 minut.
 
Nastajanje infektivnih fagov so merili kot PFU/nL. PFU pomeni število fagov, ki lahko okužijo bakterije in tvorijo plak; titer pa pomeni koncentracijo teh infektivnih fagov v vzorcu. Prve infektivne fage so zaznali po približno eni uri, po petih urah pa je titer dosegel približno 10⁵ PFU/nL. Ker je bil izmerjeni titer višji od pričakovanega brez replikacije DNA, so sklepali, da je v sintetičnih celicah prišlo do delnega pomnoževanja fagnega genoma. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5.
 
===Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS===
Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Masna CFE reakcija pomeni, da reakcija poteka prosto v raztopini, na primer v epruveti, in ni zaprta v liposome. Razlika je verjetno posledica prostorske omejitve liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti bolj lokalno zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski sistem in masna reakcija po učinkovitosti bolj podobna.
 
RdLPS je bil za sistem hkrati nujen in omejujoč. Na začetku je omogočil vezavo faga T7 na membrano in s tem vstop genoma v sintetično celico. Težava pa se je pojavila po sestavljanju novih fagov, saj so se ti lahko ponovno vezali na RdLPS v membrani. Pri fagih z močno afiniteto do RdLPS so zato zaznali približno 94 % manj prostih infektivnih delcev. To kaže, da se fagi verjetno niso izgubili zaradi neuspešnega sestavljanja, ampak so ostali vezani na receptor in zato niso bili zaznani kot prosti infektivni fagi v raztopini. RdLPS je torej omogočil začetek okužbe, hkrati pa je zmanjšal razpoložljivost potomnih fagov po njihovem nastanku.
 
===Sprostitev fagov===
Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.
 
Fage so iz sintetičnih celic sprostili z osmotskim šokom. Liposome so prenesli iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje, zato je voda začela vstopati v liposome, membrana se je porušila in fagi so se sprostili v raztopino.


Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.
Da bi preverili, ali novi fagi res nastajajo znotraj liposomov, so primerjali aktivne sintetične celice z “mrtvimi” celicami. Mrtve celice so pripravili z dodatkom RNaze A. RNaza A razgrajuje RNA, zato prepreči normalno izražanje genov v CFE sistemu. Če ni RNA, ne more potekati translacija fagnih proteinov, zato se novi fagi ne morejo učinkovito sestavljati.


Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.
Aktivne sintetične celice so po okužbi proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot celice z RNazo A. To potrjuje, da fagi niso bili samo začetni fagi, vezani na membrano, ampak so nastali z aktivnim izražanjem genov, replikacijo in sestavljanjem znotraj liposomov.


==Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS==
==Pomen raziskave in zaključek==
==Sprostitev fagov==
Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče ustvariti sistem sintetičnih celic in združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.
==Zaključek==


Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.


==Literatura==
==Literatura==
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8
[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Latest revision as of 19:25, 17 May 2026

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

Uvod

Sintezna biologija od spodaj navzgor

Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav. V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizira in sprosti fagne delce.

Namen raziskave

Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti in delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini. Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

Priprava sintetičnih celic

Zasnova membrane in uporaba RdLPS

Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Kot receptorsko komponento so uporabili RdLPS (angl. rough deep lipopolysaccharide), krajšo obliko LPS, pri kateri je sladkorni del močno skrajšan in vsebuje predvsem notranje jedro. Takšna zgradba mu daje večjo hidrofobnost, zato se v lipidno membrano liposoma vgrajuje stabilneje kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanji strani membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: palmitoil-oleoil-fosfatidilholina (POPC), fosfatidiletanolamin-polietilenglikola (PE-PEG) in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

Preverjanje delovanja membrane z RdLPS

RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Hkrati prisotnost RdLPS ni motila CFE sistema v notranjosti liposomov, kar so preverili z izražanjem reporterskega proteina mcherry.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

Vstop in izražanje fagnega genoma

Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry

Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Za preverjanje vstopa genoma so uporabili dva inženirana faga, T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v repnih proteinih. T7-mC-S* je prepoznaval RdLPS na membrani liposoma, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Poskus je temeljil na logiki: če fag vnese svoj genom v liposom, CFE sistem začne izražati mCherry in liposom zasveti rdeče.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

Neposredno spremljanje fagne DNA

Vstop in replikacijo fagne DNA so spremljali z dvema fluorescenčnima označevalcema. SYBR Gold se veže na DNA, zato so z njim zaznali prisotnost fagnega genoma v notranjosti liposomov. Po dodatku faga so se pojavili zeleni fluorescenčni skupki, kar kaže, da je fagna DNA vstopila v sintetične celice. Ob tem se je povečevala rdeča fluorescenca mCherry, kar potrjuje, da se je genom začel izražati.

Replikacijo DNA so preverili še s FITC-dCTP, fluorescenčnim nukleotidom, ki se vgradi v novo sintetizirano DNA. Tudi pri tem so opazili zelene skupke, ki so se kasneje razpršili. Takšna dinamika je skladna z nastankom dolgih povezanih kopij fagne DNA, ki se nato obdelajo in zapakirajo v nove kapside.

Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov

Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev

Čas vstopa genoma so ocenili s primerjavo dveh pogojev: pri enem je bil fagni genom že v liposomu, pri drugem pa je moral vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescence je pokazala, da prenos genoma T7 traja približno 100–105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov so merili kot PFU/nL. PFU pomeni število fagov, ki lahko okužijo bakterije in tvorijo plak; titer pa pomeni koncentracijo teh infektivnih fagov v vzorcu. Prve infektivne fage so zaznali po približno eni uri, po petih urah pa je titer dosegel približno 10⁵ PFU/nL. Ker je bil izmerjeni titer višji od pričakovanega brez replikacije DNA, so sklepali, da je v sintetičnih celicah prišlo do delnega pomnoževanja fagnega genoma. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5.

Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS

Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Masna CFE reakcija pomeni, da reakcija poteka prosto v raztopini, na primer v epruveti, in ni zaprta v liposome. Razlika je verjetno posledica prostorske omejitve liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti bolj lokalno zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski sistem in masna reakcija po učinkovitosti bolj podobna.

RdLPS je bil za sistem hkrati nujen in omejujoč. Na začetku je omogočil vezavo faga T7 na membrano in s tem vstop genoma v sintetično celico. Težava pa se je pojavila po sestavljanju novih fagov, saj so se ti lahko ponovno vezali na RdLPS v membrani. Pri fagih z močno afiniteto do RdLPS so zato zaznali približno 94 % manj prostih infektivnih delcev. To kaže, da se fagi verjetno niso izgubili zaradi neuspešnega sestavljanja, ampak so ostali vezani na receptor in zato niso bili zaznani kot prosti infektivni fagi v raztopini. RdLPS je torej omogočil začetek okužbe, hkrati pa je zmanjšal razpoložljivost potomnih fagov po njihovem nastanku.

Sprostitev fagov

Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Fage so iz sintetičnih celic sprostili z osmotskim šokom. Liposome so prenesli iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje, zato je voda začela vstopati v liposome, membrana se je porušila in fagi so se sprostili v raztopino.

Da bi preverili, ali novi fagi res nastajajo znotraj liposomov, so primerjali aktivne sintetične celice z “mrtvimi” celicami. Mrtve celice so pripravili z dodatkom RNaze A. RNaza A razgrajuje RNA, zato prepreči normalno izražanje genov v CFE sistemu. Če ni RNA, ne more potekati translacija fagnih proteinov, zato se novi fagi ne morejo učinkovito sestavljati.

Aktivne sintetične celice so po okužbi proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot celice z RNazo A. To potrjuje, da fagi niso bili samo začetni fagi, vezani na membrano, ampak so nastali z aktivnim izražanjem genov, replikacijo in sestavljanjem znotraj liposomov.

Pomen raziskave in zaključek

Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče ustvariti sistem sintetičnih celic in združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

Literatura

[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8

Retrieved from "https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Fagni_infekcijski_cikel_v_sintetičnih_celicah&oldid=26160"