Vstavitev gena rd29A:AtDREB2A CA v sojo in njegova molekulska karakterizacija v listih in koreninah med dehidracijo

Leading article: Introduction of the rd29A:AtDREB2A CA gene into soybean (Glycine max L. Merril) and its molecular characterization in leaves and roots during dehydration

Brazilija in ZDA sta največji proizvodni državi soje na svetu, kjer vsaka pridela približno 35% soje. Ko govorimo o proizvodnji in izvozu soje, se moramo zavedati, da govorimo o trgu vrednem 60 bilijonov dolarjev. Vsaka naravna katastrofa, predvsem suša, pomeni ogromne denarne izgube teh velikih držav in velik manjko soje v največjih uvoznicah (Kitajska uvozi 54% soje sveta). Potreba po sojinih kultivarih, ki so odporni na sušo in vročino je čedalje večja, saj se bo po napovedih IPCC (Intergovrnmental Panel on Climate Change, 2007) Zemljina temparatura vzdigovala v naslednjih letih, desetletjih in s tem bo prišlo do počasnega zmanjšanja površin za gojenje soje kot tudi drugih poljščin. Ena od alternativ kako minimizirati izgube v sušnih obdobjih je prav z uporabo biotehnoloških orodij.

Družina transkripcijskih faktorjev (Dehydration Responsive Element Binding - DREB) iz Arabidopsis thaliana je povezana z povečano odpornostjo proti abiotskem stresu. Znan transkripcijski faktor (TF) AtDREB2A sproži povečano izražanje proteinov kot odziv na sušo, visoko slanost in vročino. Dokazali so že, da je prekomerno izražanje konstitutivno aktivnega (CA) DREB2A v Arabidopsis thaliana pokazalo povečano toleranco na stres, ki se pojavlja pri suši (pomanjkanje vode, vročina, slanost). Prav tako so v soji so našli DREB2 gen (GmDREB2;2) in s prenosom in ekspresijo tega v Arabidopsis thaliana izboljšali njen odziv na stres. To je neposredni dokaz, da DREB podobni proteini povečajo odpornost na abiotski stres in sušnost. Poravnava sekvenc med družino DREB genov je pokazala le majhno razliko med podobnimi rastlinami v neohranjenih regijah.

V tej raziskavi so TF AtDREB2A so vstavili v sojo z biolistiko. Kultivar BR 16, ki ni odporen na sušo, so kotransformirali z konstruktoma rd29A:AtDREB2A CA in ahas:AtAHAS. Konstrukt rd29A:AtDREB2A CA je sestavljen iz promotorja rd29A, ki ga lahko induciramo s stresom ter kodirajoče regije AtDREB2A CA, ki ima izbrisano domeno za negativno regulacijo. Drugi konstrukt, ahas:AtAHAS, je potreben, ker deluje kot selekcijski marker za imazapir. Imazapir je imidazolinski herbicid, ki pri selekcionira transformirane rastline, saj preprečuje razvoj celic, ki niso dobile konstruktov.

Na začetku raziskave so imeli 6537 embrijev. Po biolistiki jih je, od 970 preiskanih, pokazalo 78 pozitivni rezultat za vstavljeni konstrukt, a sta bile le dve GS rastlini od teh brez himer; GS rastlini P1397 in P2193. Iskanje teh konstruktov so izvedli z konvencionalno PCR metod s specifičnimi začetnimi oligonukleotidi. Himerizacija je drugače pogost pojav pri biolistiki in zato so uporabili imazapir, saj ta zmanjšuje prav slednjo.

Število kopij vstavljenega transgena v T0 generaciji GS rastlin je bilo v povprečju 2-17, kar je karakteristika transformacije z biolistiko. Pri P2193 so se vstavitve transgena AtDREB2A CA zgodile na istem lokusu, saj podatki iz generacij T1 in T2 kažejo vzorec segregacije, ki sledi Mendelovim zakonom dedovanja. Southern blot je pokazal, da je v T0 generaciji je imela GS rastlina P2193 ogromno vstavljenih insertov (>48), ki jih je izgubila v tranziciji iz T0 v T1, nato pa je število insertov v generacijah T1 in T2 ostalo stabilno (0-5). Pri P1397 so v T0 generaciji opazili 9-17 kopij in 0-3 v T1. Ko so primerjali rezultate T0 in T1 generacij, so rastline P2193 kazale največjo gensko ekspresijo. To verjetno tudi namiguje na večjo stabilnost transgena v genomu P2193 v primerjavi z P1397.

Izguba transgena pri tranziciji je pogost pojav pri segregaciji gamet. Možna razlaga mehanizmov izgube je lahko, da je prišlo do intrakromosalne rekombinacija, do nestabilnost genov zaradi manipulacije tkivne kulture, ali napake v vzorcu metilacije DNA, kateri sledi eliminacija genov, ki jo aktivira obrambni mehanizem rastline.

Nivo izražanja transgena v P2193 in P1397 med dehidracijo celic v BOD inkubatorju, kaže, da se je Arabidopsis thaliana TF DREB2A aktiviral v soji. Pri T0 generaciji je bilo izražanje povečano za slab red velikosti 103 (725x pred inkubacijo) v primerjavi z BR16 in je padalo s časom v inkubatorjem. Opaziti je bilo, da je izražanje pri T1 generaciji padlo na 111x povečanje transkriptov v celici pred inkubacijo.

Visoko izražanje je bilo opaženo med dehidracijo v hidroponičnem sistemu. Po vodnem stresu je bil nivo izražanja transgena v listih in koreninah 1042x in 27750x višji kot v kontrolnih rastlinah. To kaže, da se konstrukt AtDREB2A CA diferenčno izraža v različnih delih soje. V soji imajo verjetno TF neposreden vpliv na vzdrževanje vodnega stresa v listih in koreninah in so povezani z izražanjem genov, ki so pomagajo pri zaščiti celičnih struktur pred dehidracijo.

Nivo izražanja in število kopij v celicah GS rastlin je dokaz, da je bil celični ustroj sprejel TF AtDREB2A CA. Najverjetneje se je transgen vstavil nekje v evkromatske regije, kjer ni prišlo do metilacije ali utišanja tega. V rastlini P2193 je bil transgen diferenčno izražen v listih in koreninah med pomanjkanjem vode. Nadaljne raziskave bi morale biti opravljene na GS rastlini P2193, predvsem na področju kaskade efektorskih proteinov pod regulacijo TF AtDREB2A CA. Vključiti bi bilo tudi treba ta kultivar v širše progame razvoja sojinih rastlin odpornih na sušo.