Main Page

Engineering S. equi subsp. zooepidemicus towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest

Glukozaminoglikani, kot sta hialuronska kislina (HA) in hondriotin sulfat (CS), služijo kot osnova številnih kozmetičnih izdelkov in nutracevtikov, hkrati pa zaradi visoke biokompatibilnosti in neimunogenosti vedno več pozornosti dobivajo tudi v medicinski in farmacevtski industriji.

Pridobivanje hialuronske kisline in hondroitina

HA je bila prvi glukozaminoglikan pridobljen v procesu fermentacije. Več kot 90 % HA dostopne na trgu je danes pridobljene iz Streptococcus zooepidemicus in Bacillus subtilis. Hondroitin pa je še vedno pridobljen iz omejenih in potencialno nevarnih živalskih virov. Prvi poskusi biotehnološke proizvodnje hondroitina so uporabljali rekombinantni sev E. coli K4, ki je vseboval encime za proizvodnjo hodroitina. Hondoritin se od CS v strukturi sicer nekoliko razlikuje, vendar v nekaterih primerih kaže celo boljše rezultate pri zmanjšanju vnetja. Poleg tega obstajajo kemijski postopki, ki omogočajo pretvorbo hondroitina v CS. Glavna ovira pri uporabi E.coli K4 za proizvodnjo hondroitina je tvorba lipopolisaharidov, ki se kot stranski produkti izločajo v medij in tako predstavljajo velik delež kontaminantov. Z namenom, da bi se izognili postopkom čiščenja in sočasno pridobivali oba industrijsko zanimiva glukozaminoglikana, so Donatella Cimini in sodelavci pripravili rekombinantni sev S. zooepidemicus.

Priprava rekombinantnega seva S. zooepidemicus

Sev E.coli K4 vsebuje skupino genov K4, ki omogočajo sintezo polisaharidov. Znotraj njih se nahajata gena kfoC in kfoA. Gen kfoC zapisuje za hondroitin polimerazo, gen kfoA pa za epimerazo, ki katalizira pretvorbo N-acetilglukozamina (GlcNAc) v N-acetilgalaktozamin (GalNAc). Oba gena sta ključna za sintezo hondroitina, zato so jih z uporabo začetnih oligonukleotidov z restrikcijskimi mesti in genomske DNA E.coli K4 pomnožili v reakciji PCR. Uspešnost pomnoževanja so preverili z agarozno gelsko elektroforezo nato pa ustrezne DNA fragmente izolirali ter vstavili v vektor pNZ8148 pod inducibilni promotor nisA. Vektor je vseboval tudi zapis za odpornost proti kloramfenikolu. Tako pridobljen vektor pNZ8148kfoAkfoC so transformirali in klonirali v L. lactis, ki so rasle na gojišču s kloramfenikolom. Vektor so izolirali iz celic in preverili uspešnost ligacije z restrikcijo. Z elektroporacijo so nato vektor pNZ8148kfoAkfoC prenesli v industrijski sev S. zooepidemicus BA06, ki se sicer že uporablja za biotehnološko proizvodnjo HA.

Pogoji gojenja rekombinantnega seva S. zooepidemicus

Transformirane S. zooepidemicus BA06 so gojili v 3 stresalnih steklenicah ob prisotnosti kloramfenikola in nizina, ki je induciral izražanje genov kfoA in kfoC. Ena izmed stresalnih steklenic je vsebovala obogateno gojišče, druga je vsebovala obogateno gojišče in 0,5 mM GalNAc, tretja pa obogateno gojišče in 2 mM fosfatidilholin. Dodatek GalNAc naj bi povečal proizvodnjo hondroitina, fosfatidilholin pa naj bi povečal proizvodnjo in končno molekulsko maso HA. Vzporedno so gojili transformirane S. zooepidemicus BA06 tudi v manjšem bioreaktorju z obogatenim gojiščem.

Rezultati

Rekombinantni sev S. zooepidemicus BA06 v stresalnih steklenicah je povprečno proizvedel okrog 400 mg/L hialuronske kisline in 90 mg/L hondroitina. Identifikacijo molekulske mase in strukturo hialuronske kisline ter hondroitina so potrdile analize SEC-TDA in HPAE-PAD kromatografije, ter NMR spektroskopije. Medtem ko se je skoraj celotna količina proizvedene hialuronske kisline nahajala v mediju, se je med 15 in 27 % proizvedenega hondroitina nahajalo znotraj celic. Razlog za to bi lahko bil slabši sekrecijski sistem hondroitina. Dodatek GalNAc je povečal količino znotrajceličnega hondoritina (80 %) in zmanjšal porabo sukroze v gojišču za 30 %, ni pa povečal proizvodnje hondroitina. Dodatek fosfatidilholina ni povečal proizvodnje HA, čeprav je povečal povprečno molekulsko maso polimera za 18 %. Pri tem je bila povprečna molekulska masa proizvedene HA 1,98 kDa. Proizvodnja HA in hondroitina v bioreaktorjih je znašala 1,46 g/L in 0,3 g/L. Porazdelitev HA in hondroitina zunaj in znotraj celic je bila enaka kot v primeru stresalnih steklenic brez dodatka GalNAc. Povprečna molekulska masa HA iz bioreaktorja je znašala 1,75 ± 0,14 MDa, hodroitina pa 25 ± 3 kDa.

Zaključek

Znanstveniki so uspešno pripravili rekombinantni sev S. zooepidemicus, ki je bil sposoben sočasne proizvodnje dveh industrijsko zanimivih biopolimerov, hialuronske kisline in hondroitina. Razmerje med količino proizvedene HA in hondoritinom je bilo v eksperimentu s stresalnimi steklenicami z obogatenim gojiščem in bioreaktorjem z enakim gojiščem enako. Zunajcelično razmerje je znašalo 5:1, znotrajcelično pa 1:4/5. Biomasa zaradi slabše sekrecije hondroitina tako predstavlja vir nizkomolekularnega hondroitina, supernatant pa vir skoraj popolnoma čiste HA z visoko molekulsko maso.

MBT seminarji 2017