Quantifly

Ionis Paris - Quantifly

Uvod

V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (ang. volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo nekaterih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

Biosenzor

Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

Načrtovanje biosenzorja

Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste Escherichia coli, DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste Pseudomonas putida. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca Gaussia princeps. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

Optimizacija plazmida

Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo CelloCAD. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (ang. relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (ang. green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

Karakterizacija biosenzorja

Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (ang. red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (ang. ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z monokromatskim čitalcem. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev E. coli sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje. Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

Strojna oprema

Dron

Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

Epruveta za bakterije

Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

Zaključek

Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacije v bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov. Kljub nekaterim pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

Vir

Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016

Seminarji SB 2016/17