Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus

Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of Vibrio anguillarum and evaluation them as vaccine candidate for flounder (Paralichthys olivaceus)

Vibrio anguillarum je slanoljubna ter po Gramu negativna bakterija, ki povzroča hemoragično septikemijo pri ribah po celem svetu ter zaradi pomanjkljive in neučinkovite preventive povzroča ogromne ekonomske izgube v akvakulturni industriji. Obstajajo pa že kandidatna cepiva proti V. anguillarum. S pomočjo celotnega zaporedja genoma bakterije ter bioinformatskih analiz so namreč lahko določili zaporedje genov, ki kodirajo imunogene proteine, ter predvideli njihovo lokalizacijo na subcelični ravni. Tako so s tehnologijo rekombinantne DNA pripravili cepiva iz delov patogena (»subunit vaccines«). V študiji so izbrali šest potencialnih antigenskih determinant iz V. angillarum in ovrednotili njihovo učinkovitost za zaščito ribe P. olivaceus.

Priprava kandidatnih cepiv

Iz podatkovne baze Genbank so pridobili zaporedja genov, ki kodirajo šest izbranih proteinov in imajo pomembno vlogo pri preživetju in patogenosti V. anguillarum: virulenčni protein A (VirA), proteina K in R zunanje membrane (OmpK in OmpR), stresni protein 33 (Hsp33), flagelin C (FlaC) ter protein CheR. S pomočjo bioinformatskih analiz so določili še subcelično lokalizacijo proteinov, transmembranske domene, izolelektrične točke ter molekulske mase. Zapis za specifičen protein so ligirali v vektor PEASY-E1 ter z metodo toplotnega šoka transformirali E. coli BL21 (DE3). Po uspešni selekciji so bakterije prenesli v tekoče gojišče LB bujon in jih kultivirali do sredine logaritemske faze rasti. Očiščene rekombinantne proteine so nato ločili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo in določili njihovo molekulsko maso. Nato so jih prenesli na membrano in ugotavljali, ali protitelesa proti V. anguillarum (fV-ab), ki so jih izolirali iz P. olivaceus, lahko reagirajo z očiščenimi proteini. Pripravili so osem različnih vzorcev, ki so jih injicirali v ribe: šest vzorcev s specifičnim očiščenim rekombinantnim proteinom, vzorec z V. anguillarum, ki so jih inaktivirali s formalinom (FKC), ter kontrolni vzorec s PBS. Pred imunizacijo so vsakemu vzorcu dodali adjuvans.

Cepljenje rib, vzorčenje, preizkus učinkovitosti

Ribe P. olivaceus, neokužene z V. anguillarum, so naključno razporedili v osem skupin (150 rib/skupina) ter jim intraperitonealno injicirali po 100 μl določenega vzorca. Vsak teden (7-krat) po imunizaciji so šestim ribam iz vsake skupine odvzeli kri, izolirali limfocite ter pripravili serum. S pretočno citometrijo so določili delež celic s površinskim imunoglobulinom (celice sIg+). S testom ELISA pa so v serumu določili titer protiteles. Določali so titer fV-ab, titer protiteles proti rekombinantnim proteinom ter titer celokupnih protiteles. Peti teden po imunizaciji so 80 ribam iz vsake skupine intraperitonealno injicirali 100 μl žive V. anguillarum. 15 zaporednih dni so spremljali umrljivost in izračunali relativno preživetje (RPS) po enačbi: RPS = [1 – (delež poginulih rib v skupini/delež poginulih rib v kontrolni skupini)] x 100 %.

Rezultati in zaključki

Uspešno so izrazili vseh šest rekombinantnih proteinov, ki so po molekulski masi ustrezali naravnim proteinom, ter s prenosom western pokazali, da vseh šest lahko reagira s fV-ab. Injiciranje očiščenih rekombinantnih proteinov je pri ribah povzročilo namnožitev limfocitov sIg+ ter tvorbo celokupnih protiteles in specifičnih protiteles proti V. anguillarum oziroma rekombinantnim proteinom. Titer protiteles je po injiciranju vzorcev najprej naraščal, dosegel vrh in v zadnjih tednih merjenja upadel. 15 dni po injiciranju žive V. anguillarum so RPS za rekombinantne proteine FlaC, CheR, OmpR, OmpK, VirA ter Hsp33 znašali: 16,22 %, 27,03 %, 45,95 %, 62,16 %, 70,27 % ter 81,08 %. RPS za FKC je znašal 56,76 %. V vranici, jetrih ter ledvicah poginulih rib niso zaznali prisotnosti drugih bakterij, s čimer so pokazali, da je bil vzrok smrti dovzetnost za okužbo z V. anguillarum. V študiji so tako pokazali, da rHsp33, rVirA ter OmpK ribam P. olivaceus nudijo dobro zaščito pred V. anguillarum, zato bi jih lahko uporabili kot kandidatna cepiva.