Pogosta genetska variacija vodi v molekularno heterogenost induciranih pluripotentnih matičnih celic

Common genetic variation drives molecular heterogeneity in human iPSCs

Uvod

Tehnologija inducirane pluripotentne matične celice (iPMC) ima velik potencial za zagotovitev izboljšanih celičnih modelov za človeške bolezni. Vendar pa različna genetska in fenotipska karakterizacija obstoječih iPMC linij omejuje njihovo potencialno rabo za raziskave in terapije. V tej študiji so opisali sistematično generacijo, genotipiziranja in fenotipiziranja 711 odprto dostopnih človeških iPMC linij pridobljenih iz 301 zdravih posameznikov kot del Hipsci (Human Induced Pluripotent Stem Cells Initiative).

Zbiranje vzorcev in pridobivanje iPMC

Vzorce so zbrali s kožnimi biopsijami zdravih nepovezanih prostovoljcev. Fibroblaste so reprogramirali z uporabo Sendai vektorjev, ki so izražali hOCT3/4, hSOX2, hKLF4 in hc-MYC50, na hranilni plasti mišjih embrijonskih fibroblastih. Za 307 linij so kvantificirali izražanje pluripotentnih markerjev (NANOG, OCT4 in SOX2). 372 linij pa so diferencirali v nevroektoderm, mezoderm in endoderm in izmerili izražanje treh potomsko specifičnih diferenciacijskih markerjev. Izbrali so 1-2 visoko kvalitetni liniji na donorja za nadaljno fenotipizacijo.

Pluripotentnost in genetska stabilnost

Celične linije so profilirali z uporabo Tier 1 seta, ki vključuje mrežno genotipizacijo in profiliranje izražanja genov iPMC in njihovih fibroblastnih progenitorjev, kot tudi oceno pluripotentnih in diferenciacijskih lastnosti iPMC. Z uporabo celomike so kvantificirali frakcijo celic, ki izražajo vsak marker pluripotentnosti individialno in ocenili, da povprečno med 18 in 62% celic v iPMC linijah ko-izražajo vse tri pluripotentne markerje: NANOG, OCT4 in SOX2. Skoraj vse linije (>99%) so uspešno producirale celice iz vseh treh zarodnih plasti med usmerjeno diferenciacijo. V kulturah matičnih celic so pogosto opažene anveplodije in subkromosomske aberacije. Z uporabo genotipizacijskih mrež so zaznavali alteracije v številu kopij (CNA) med originalnimi fibroblasti in iPMC linij pridobljenih iz njih. Večina CNA-jev bila unikatna v posamezni iPMC liniji, 22% CNA-jev bilo opaženih v najmanj eni podvojeni liniji istega donorja, 15% pa so jih opazili v vseh podvojitvah.Z primerjanjem linij istega donorja, tistih z in brez CNA-jev so ugotovili, da je bila ponovna duplikacija na kromosomu 17 povezana z največjim številom sprememb v izražanju genov, vključno z 1,098 trans lociranih genov na drugih kromosomih. Zaznali so tudi povečano in zmanjšano stopnjo v celični rasti povezano z CNA-ji na kromosomu 17 in 20.

Izvori heterogenosti iPMC

Z primerjavo večih neodvisnih celičnih linij istega posameznika so lahko kvantificirali razlike med posamezniki (učinek donorja) in sistematično primerjati to varianco s tisto, ki jo prispevajo drugi faktorji. Kot po pričakovanjih so tehnične spremenljivke pojasnile največji del variacije, vendar pa so ugotovili tudi dosledne, statistično signifikantne učinke donorja na večini testiranih fenotipov iPMC, od številčnosti mRNA in proteinov do celičnih fenotipov kot so pluripotentnost, diferenciacijska kapaciteta in morfologija. Učinek donorja je pojasnil 5,2-26,3% variance.

Identifikacija regulatornih variant specifičnih za iPMC

Da bi karakterizirali kako je transkriptom pluripotentnih celic oblikovan s strani pogostih genetskih razlik med posamezniki so z uporabo RNA-seq podatkov od 166 nepovezanih donorjev kartirali ekspresijski kvantitativni lokus (eQTL)v 1Mb cis-območju od začetka gena. Identificirali so 6,631 genov z eQTL. Lastnosti teh genov so bile podobne tistim v drugih celičnih linijah in somatskih tkivih. Z testiranjem replikacije njihovih eQTL signalov v 44 somatskih tkivih od GTEx so definirali 2131 genov (eGgeni) , ki so bili specifični za iPMC.

iPMC eQTL-ji označujejo pogoste oblike bolezni

Vrednost iPMC za eksperimente genetskega inženirstva je znana, veliko manj pa je poznan njihov pomen kot tip celičnega modela za funkcionalno interpretacijo pogostih bolezensko povezanih variant. Da bi to raziskali so prekrivali vse iPMC eQTL-je (glavne variante) z NHGRI-EBI katalogom za asociacijske študije na ravni genoma (GWAS). En primer variante, ki so jo našli v katalogu je rs10069690 glavna eQTL varianta za TERT (telomerazna reverzna transkriptaza) gen. Ta varianta je povezana z zarodno predispozicijo sedmih oblik raka.

Zaključek

Ta raziskava opisuje glavne vire genetske in genotipske variacije v iPMC in določa njihovo ustreznost kot modeli kompleksnih človeških lastnosti. S profiliranjem genoma so ugotovili, da 5-46% variacij v različnih iPMC fenotipih, vključno z diferenciacijsko kapaciteto in celično morfoloijo izhaja iz razlik med posamezniki. Velika prednost genetske študije iPMC v primerjavi z drugimi nesmrtnimi celičnimi linijami je, da lahko učinke analiziramo in jih primerjamo v različno pridobljenih celičnih tipih z enakim genetskim materialom.

Vir

http://www.nature.com/nature/journal/vaap/ncurrent/full/nature22403.html