Pilus+

iGEM ekipa Exeter 2017 je želela odpraviti lokalni problem onesnaženosti vod s težkimi kovinami, ki so prišle iz zapuščenih rudnikov, katerih onesnaženje zajema Cornwall, Devon in Angleški kanal. Poleg vod, je nevarnost tudi vdihavanja, zaužitja in kožne absorpcije, saj je mesto priljubljena turistična točka. Ker so trenutne metode čiščenja predrage, odpadni produkti pa še vedno ostajajo, si je ekipa zamislila projekt, s katerim bi ustvarili filtracijsko enoto za bioremediacijo škodljiv vod, ki bi temeljila na gensko spremenjenih bakterijah, ki bi vezale težke kovine iz vode.

Pilusi tipa I

To so majhne, laskom podobne proteinske strukture na površini nekaterih gram negativnih bakterij, ki se uporabljajo za medcelično signalizacijo in tvorbo biofilma. Sestavljeni so iz štirih podenot (FimH, G, F in A) zapisanih v operonu fim. Veliko genov fim je povezanih s šaperonsko-usmerjavalnim sistemom (angl. Chaperone–usher pathway), ki ga sestavljajo pomožni proteini potrebni za sestavljanje pilusa in njegovo izločanje na površino celice. Glavna podenota je strukturni protein FimA, ki polimerizira in tvori osnovo pilusa. Za vezavo na gostiteljske celice pa je odgovoren protein FimH, ki se nahaja na koncu pilusa. Gre za 300 AK dolg protein, sestavljen iz dveh domen: lektinske domene z vezavnim mestom za manozo in pilin domene. Vezavna domena za manozo je mesto patogenosti, saj se preko nje bakterija veže na D-manozilirane proteine evkariontskih epiteljskih celic, kar povzroči okužbo. Zaradi sposobnosti vezave FimH na manozo, je iGEM ekipa želela uvesti nove vezavne domene za kovine znotraj pilusov E. coli.

Biološko konstruiranje

Glede na rezultate analize vzorcev vod s področja rudnika, so izbrali proteine, ki jih želijo preučiti za vezavo kovin: mišji metalotionein za kadmij, baker in cink, metalotionein iz Synechococcus za kadmij in cink, plastocianin iz Synechococcusz za baker (konstrukt s plastocianinom jim ni uspel) in poli-Histidinska (6xHis) oznaka za nikelj

S pomočjo podatkov iz literature so preučili mesta insercije v FimH in tako konstruirali različne FimH modifikacije, ki so jih testirali preko izražanja super zvitega GFP (sfGFP).

Izbira šasije

Potrebovali so šasijo, ki sama ne izraža pilusov. Uporabili so različne seve E.coli, ki so jih testirali na prisotnost operona fim. Z ekstrakcijo genoma in PCR so izolirali in pomnožili tri znane gene operona fim. Produkte so dali na agarozni gel, kjer so preverili prisotnost lis, ki predstavljajo te tri gene. Sevi, ki genov niso vsebovali, so bili primerni za izražanje modificiranega FimH. Uporabili so seve BL21(DE3), Top10, ΔFimB in ΔFimH.

Sestavljanje konstruktov

Za sestavljanje konstruktrov so uporabili princip modularnega kloniranja, kjer se uporablja restriktaza BsaI, ki reže zunaj prepoznavnih mest in omogoča tvorbo različnih 4 bp dolgih previsnih koncev. Te uporabnik definira sam in preko njih sestavlja dele DNA. Podatki iz literature nakazujejo, da so protein FimH uspešno modificirali na mestu 1, 225 in 258, kjer so uvedli heterologne proteinske segmente. S konstrukcijo različnih FimH modifikacij so testirali vezavne proteine za kovine in hkrati preko izražanja sfGFP določili katero mesto insercije je najugodnejše. Sestavili so operon fim pod kontrolo dveh različnih promotorjev in šest modificiranih fimH (in wt fimH) pod kontrolo različnih promotorjev in jih testirali.

Rezultati so pokazali, da se v primeru konstrukta T7_FimH_225_sfGFP - fuzijski protein FimH in sfGFP na mestu 225, pod kontrolo T7 z IPTG inducirajočega promotorja, z RBSjem in terminatorjem; fluorescenca v sevu BL21(DE3) poveča, glede na divji tip seva, kar pomeni da se modificiran FimH pravilno zvije in izraža, ne glede na sfGFP. s prenosom Western so pokazali, da se protein nahaja večinoma v citoplazmi, prisotnost na površini celic pa so dokazali s preverili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo z Immunogold označevanjem.

Konstrukt P_Rha_FimH_1_His, ki je pod kontrolo inducibilnega ramnoznega promotorja promotorja in ima kot reporterski del oznako 6xHis, sestavljen del pa sestavljata še RBS in terminator, se je ob dodatku 2 % ramnoze izražal v vseh štirih sevih. Z afiniteto do anti-His protiteles so dokazali tudi uspešno sintezo oznake 6xHis. Z gelsko elektroforezo so pokazali razliko v molekulskih masah konstruktov iz česar so sklepali, da se signalni peptid uspešno odcepi in konstruiran protein potuje iz celice in tvori pilus.

Biološki deli

Pripravili so tri konstrukte fuzijskega proteina FimH s sfGFP na treh različnih mestih: FimH_1_sfGFP (BBa_K2324002), FimH_225_sfGFP (BBa_K2324001) in FimH_258_sfGFP (BBa_K2324003). Ti so bili namenjeni enostavnemu spremljanju izražanja FimH. Osnovni deli FimH_1_His (BBa_K2324014), FimH_1_SynMT (BBa_K2324004) in FimH_1_MouseMT (BBa_K2324005) so bili namenjeni vezavi kovine. Operon fim, ki je sicer sestavljen iz šestih proteinov in nativnega RBS zaporedja je razdeljen v tri ločene dele, in ga je ustvarila že Harvardska 2015 iGEM ekipa (BBa_K2324016, BBa_K2324017, BBa_K2324018).

Za sestavljene dele so uporabili pet promotorjev: T7 promoter (BBa_K1614000),P_Rha (BBa_K902065), P_ara (BBa_I13453), z IPTG inducibilni T5 promoter (pQE30-Qiagen) in P_J23100 (BBa_J23100). Za RBS so izbrali močan in dobro okarakteriziran BBa_B0034, BBa_B0015 pa je služil kot dvojni terminator.

Vse dele je sintetiziralo podjetje Integrated DNA Technologies kot gBlocks, sestavljeni deli pa so bili sestavljeni po principu modularnega kloniranja. Vsi FimH konstrukti so bili vstavljeni v pSB1A3, operon fim pa v pX1'6'0'0 (sintetiziran v laboratoriju). Vsi uspešno sestavljeni deli, so predstavljeni v pSB1C3.

Dvoplazmidni sistem

Pripravili so dvoplazmidni sistem, kjer je zapis za modificiran FimH na enem plazmidu, ostali proteini operona fim pa na drugem plazmidu. Plazmida sta vsebovala kompatibilni ori regiji (pUC in p15A) in različna gena za rezistenco na antibiotik (AmpR in CmR), ki je omogočala kotransformacijo E. coli.

Plazmid z zapisom za modificiran FimH protein, je pod kontrolo ramnoznega inducibilnega promotorja. Ramozni inducibilni promotor je uporabljen skupaj z močnim in dobro okarakteriziranim B0034 RBS-jem in B0015 terminatorjem. Izraža se fuzijski protein, ki ga sestavlja FimH in ali sfGFP (reporter), 6xHis oznako (reporter in vezava kovine) ali dva različna metalotioneina (vezava kovine).

Drugi plazmid je vseboval preostanek operona fim, ki vsebuje šest kodirajočih zaporedij z nativnim RBS-jem (ne pa fimH) potrebnih za biogenezo celotne strukture pilusa. Operon je pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja in je plazmid z majhnim številom kopij, s čimer so se izognili prekomernemu izražanju in metabolnemu bremenu.

Uporaba konstruktov

Z vidika uporabnosti so sestavili prototip filtra za čiščenje vod rudnikov. Obstoječe metode za čiščenje težkih kovin iz vod, so drage in proizvajajo veliko nevarnega odpada, ki se ne reciklira ali čisti ampak odlaga v luknjo v zemlji. Ker je velika nevarnost sproščanja GSO v okolje, so razvili tri-stopenjski filtracijski sistem, ki je sestavljen iz hidrociklona, reaktorja, ki veže kovine in mehanizma za biovarnost. Zaradi modularnosti je vsaka komponenta samostojna, in se jo lahko adaptira ali spremeni glede na potrebe. Filter so načrtovali v skladu s trenutnimi standardi.

Hidrociklon

Hidrociklon je filter, ki ločuje delce iz raztopine. Natisnili so ga s 3D tiskalnikom in je izdelan je tako da preprečuje zamašitev reaktorja za vezavo kovin s sedimentom. Glede na velikost in obliko lahko filtriramo vse od peska do mikroalg, geometrija hidrociklona pa se lahko prilagodi potrebam uporabnika. Veliko prednost v industriji ima, ker je sestavljen enostavno in nima gibajočih se delov.

Reaktor za vezavo kovin

Reaktor vsebuje tekoče gojišče z E.coli in je del namenjen zadrževanju GS bakterij. Vodo, ki so ji odstranili večje delce, se z vrha spusti v reaktor. Ko po cevi potuje nazaj gor pride v kontakt z bakterijami. E. coli rastejo na polipropilenski odrski obročasti strukturi, nastanek biofilma pa spodbudijo z uporabo surfaktanta. GS bakterije bodo ostale znotraj reaktorja, pilusi pa bodo lahko prevzeli kovinske ione iz vode. Voda se nato izteka v del za biovarnost.

Mehanizem za biovarnost

Tretji del je namenjen omejevanju GS bakterij. V ta namen, filter vsebuje komponente za zagotavljanje varnosti in kvalitete – baktericidne mehanizme, ki preprečujejo sproščanje GSO v okolje. Ekipa je testirala učinkovitost UV svetlobe kot baktericidnega mehanizma. Pokazali so, da 10 minutna izpostavljenost UV ubije 84,3 % bakterij, kar pa ne zagotovi zadostne celične smrti in zato ni uporabna v filtracijskem sistemu. Po industrijskem standardu je namreč pobeg celic lahko reda 10^-8, kar pomeni, da bi vodo morali obsevati veliko dlje časa, kar pa ni praktično za trenuten namen uporabe. Kot alternativo so omenjali antimikrobno sredstvo - kroglice bakrovega alginata in ozon

Model

Pripravili so tudi matematični model, s katerim so optimizirali izvedbo in izmerili učinkovitost pri različnih pogojih. Uporabnik v vmesnik vpiše koncentracijo kovinskih ionov, ki jih želi odstraniti iz vode in vrednost na katero želijo zmanjšati koncentracijo. Lahko spremenijo pretok in volumen reaktorja, da najdejo najbolj primerne pogoje za svojo uporabo. Model predstavi koncentracijo ionov, ki preidejo skozi filter v določenem času. Filtracijski sistem vsebuje GS E.coli, ki imajo neko končno število pilusov in zato omejeno število vezavnih mest. Število mest so predpostavili glede na podatke iz literature. Model to dejstvo vključuje in skuša najti najbolj učinkovit čas za zamenjavo filtra, uporabnika obvesti o tem s čimer se ta izogne nepotrebnemu prehajanju vode brez omogočene filtracije.

Viri

povzeto po delu ekipe Exeter iGEM 2017 (povzela Tina Šimunović)

A. Busch in G. Waksman Chaperone–usher pathways: diversity and pilus assembly mechanism

BostonU iGEM 2013