Aflatoxout

Povzeto po projektu iGEM ekipe iz Tajvana [1]

(Nataša Traven)

Aflatoksini so naravni mikotoksini, ki jih izločajo nekatere glive plesnivke, predvsem Aspergillus flavus in Aspergillus parasiticus. Najbolj pogosto okužene kulturne rastline so koruza, arašidi, pšenica, oreščki; prisotni so lahko tudi v mleku ali jajcih živali, ki se je hranila s kontaminirano krmo. Velik problem predstavljajo predvsem v hrani s pretečenim rokom uporabe in v nepravilno skladiščeni hrani (na toplem in vlažnem), ki omogoča rast plesnim. Za sesalce je najbolj toksičen in karcinogen aflatoksin B1. Živali, ki zaužijejo z aflatoksinom B1 okuženo hrano, lahko razvijejo akutno aflatoksikozo in/ali kronične probleme z zdravjem (z aflatoksinom induciran hepatocelularni karcinom). O zastrupitvah z aflatoksinom v hrani so poročali že neštetokrat (vse od leta 1960), toda kljub temu trenutno še nimamo protistrupa (zdravila) za to bolezen. Ekipa iz Tajvana (CSMU_NCHU_Taiwan) je zato za iGEM tekmovanje pripravili projekt z naslovom Aflatoxout, v katerem so predstavili priročen, učinkovit in dostopen način za obvarovanje ljudi pred škodljivimi učinki aflatoksina. Projekt je sestavljen iz treh delov. Prvi del je namenjen iskanju protistrupa, ki bi ublažil škodljive učinke aflatoksina, drugi del predstavlja zasnovo testnega traku za detekcijo aflatoksina, zadnji, tretji del pa je oblikovanje aplikacije, ki bi združevala informacije o varnosti hrane.

Protistrup za aflatoksin B1

Cilj ekipe iz Tajvana je oblikovati kapsulo, ki bo vsebovala encime za razgradnjo aflatoksina. Od F420-odvisne reduktaze so encimi, za katere je znano, da razgrajujejo aflatoksine [2]. Iz NCBI baze podatkov so pridobili zaporedje za varianto encima, ki je po raziskavah pokazala najboljšo razgradnjo aflatoksina B1 in G1. Uporabili so gen, ki kodira za encim MSMEG5998 (FDR) iz Mycobacterium smegmatis. Za delovanje tega encima je potrebna aktivna oblika kofaktorja F420 (F420H2), ki je v celici nestabilen in se zlahka oksidira do F420. Zato so morali pripraviti dodaten konstrukt, ki bo ohranjal visok nivo kofaktorja v aktivni, reducirani obliki. Uporabili so od F420 odvisno glukoza-6-fosfat dehidrogenazo (FGD)( iz Mycobacterium smegmatis), saj katalizira reakcijo, pri kateri nastaja reduciran F420. V številnih študijah so za povečanje topnosti tarčnih proteinov in preprečevanje nastanka inkluzijskih telesc pripravili fuzijo s tioredoksinom [3] in po tem se je zgledovala tudi ekipa iz Tajvana. V projektu so zato preko povezovalnega peptida povezali tioredoksin z izbranima encimoma za razgradnjo aflatoksina (MSMEG5998 in FGD). Sekvenco za tioredoksin so vstavili pred gen za posamezen encim in na ta način po transkripciji pridobili 2 različna fuzijska proteina (Tioredoksin-MSMEG5998 in Tioredoksin-FGD). Na konec so dodali heksahistidinsko oznako (6xHis-tag), ki je olajšala čiščenje. Uporabili so T7 promotor z lac operatorsko regijo, zato so ekspresijo fuzijskega proteina lahko izvedli z dodatkom IPTG.

Način delovanje aflatoksina: prisotnost aflatoksina v telesu povzroči poškodbo na DNA, kar sproži kaskado popravljalnih mehanizmov. Končen rezultat je fosforilacija in s tem aktivacija p53. Indirektno, preko povečanega izražanja proteinov v signalni poti p53, lahko sklepamo, ali je prišlo do poškodbe DNA zaradi aflatoksina. Predpostavljali so, da lahko encim MSMEG5998 neposredno zmanjša genotoksičnot aflatoksina in tako posredno inhibira aktivacijo p53 signalne poti, saj pride do razgradnje aflatoksina.

Rezultati

Pripravili so štiri različne konstrukte (za encima MSMEG5998 in FGD in za fuzijska proteina Tioredoksin-MSMEG5998 in Tioredoksin-FGD), ki so jih klonirali plazmide s standardnim ogrodjem (pSB1C3). Nato so izvedli transformacijo v E. coli in za ekspresijo (fuzijskih) proteinov dodali IPTG. Z nikelj-afinitetno kromatografijo so izolirali želene proteine, ki so jih detektirali z NaDS-PAGE. Uspešno so izolirali tako encim MSMEG5998, ki je velik 18,9 kDa, kot tudi encim FGD (37kDa), toda koncentracija izoliranega MSMEG5998 je bila znatno nižja (približno 0,16 mg/ml) v primerjavi z FGD (približno 2 mg/ml). Uspešno so izolirali tudi oba fuzijska proteina. Ugotavljali so tudi, ali se topnost encima poveča, če je nanj kot fuzijski protein vezan tioredoksin. Pripravili so prenos western (WB) iz peleta in supernatanta, da bi na ta način detektirali količino encimov v vsaki od frakcij. Ekspresija MSMEG5998 v supernatantu je bila približno enakovredna pri obeh tipih encimov (s fuzijo ali brez), medtem ko pri encimu FGD prisotnost v supernatantu ni bila tako močna, torej so ti encimi slabše topni.

Rezultati razpada aflatoksina

Za preučevanje viabilnosti celic v prisotnosti aflatoksina so uporabili celično linijo Hep G2 (humani hepatični karcinom), ki je pogosto uporabljena celična linija za preučevanje poškodb, povzročenih z aflatoksinom. Celice so tretirali z različnimi koc. aflatoksina B1 in nato spremljali preživetje. Statistično signifikantni razliki v preživetju se pojavita po 48 urah pri koncentracijah aflatoksina 5 in 10 μM, saj se smrtnost poveča na 32 % pri 5 μM in 46% pri 10 μM . Ugotovili so, da aflatoksin ne prizadene celične viabilnosti tako močno kot so pričakovali. Zelo jasno so ugotovili, da aflatoksin B1 vodi v poškodbe DNA v uporabljeni celični liniji (HepG2) po 48 urah. Izvedli so imunocitokemijski test, pri katerem so s protitelesi (proti γH2AX) detektirali γH2AX, ki je eden glavnih posrednikov pri odzivu na poškodbo DNA in injicira popravljanje dvojnih prelomov DNA. Pri treniranju celic z najvišjo konc. aflatoksina (10 μM) so dobili očiten fluorescenčni signal, ki kaže na prisotnost γH2AX. Pri nižjih konc. aflatoksina je bil signal nesignifikanten. Poleg tega so preverjali ekspresijo nekaterih proteinov v signalni poti p53 po tretiranju z aflatoksinom. Dokazali so, da je aflatoksin induciral izražanje p53, p21 in p-Chk1.

Rezultati encimske aktivnosti

Ugotovili so, da imata tako originalni encim MEMEG5998, kot tudi fuzija tega encima s tioredoksinom, visoko aktivnost in razgrajujeta aflatoksin v 60%. Učinek fuzijskega proteina (Tioredoksina+MSMEG5998) je še malenkost boljši od originalnega. Spremljali so tudi odvisnost razgradnje aflatoksina do časa in rezultate detektirali na dva načina, z merjenem absorbance pri 365 nm in z ELIS-o. Ugotovili so, da je količina razgrajenega aflatoksina odvisna od časa inkubacije skupaj z encimom in da ima fuzijski protein tioredoksina+MSMEG5998 boljšo aktivnost kot originalni MEMEG5998, saj razgradi kar 83 % toksina v 8 urah. Potrdili so, da MEMEG5998 zmanjša aktivacijo signalne poti p53, ki jo aktivira aflatoksin. Po 24 urah so celice so po tretiranju z aflatoksinom lizirali in pripravili WB, s katerim so detektirali proteine signalne poti p53. Ugotovili so, da se ekspresija p-Chk1, p-Chk2, p-p53, p53 in p21 zniža pri vzorcu z dodanim encimom.

Testni trak za detekcijo aflatoksina B1 (imunokromatografija)

Tradicionalni način za detekcijo aflatoksina B1 je z uporabo HPLC ali ELISA-e. Kljub temu da so rezultati sicer zelo natančni, sta obe metodi dolgotrajni in dragi. Zato se je ekipa odločila za pripravo preprostejšega senzorja na podlagi imunokromatografskega traku. Imunokromatografski trakovi temeljijo na specifični interakciji med antigenom (aflatoksin) in protitelesom, ki je vezano na zlate nanodelce. Kompleks nato preko fiksiranih antigenov potuje do sekundarnih protiteles, kamor se specifično veže in na koncu pokaže rezultat v obliki obarvane linije. Imunokromotografski trakovi tradicionalno vsebujejo monoklonska protitelesa, specifična za vezavo aflatoksina. Priprava takih protiteles zahteva ogromno časa, primerne opreme in je zelo draga. Zato se je ekipa odločila pa pripravo naprednega imunokromatografskega traku na osnovi fuzijskega proteina, pri katerem bi namesto klasičnega protitelesa uporabili enoverižni variabilni fragment (scFv) in fluorescenčni protein za detekcijo. Fuzijski sistem scFv-rdeči fluorescenčni protein (RFP) so sestavili iz treh domen, scFv proti aflatoksinu, rigidni povezovalni petid in RFP, dodana pa je še oznaka His-tag. Za proces imunokromotografije je potrebno najprej izolirati aflatoksin iz vzorca, za kar so načrtovali posebno naprav

Rezultati

Rdeči fluorescenčni protein so dodali z namenom, da bi se izognil uporabi zlatih nanodelcev in olajšali detekcijo aflatoksina. Toda kolonije, ki so jih dobili po transformaciji, niso izražale vidno rdeče barve, kot so pričakovali. Ko so fuzijski protein očistili, do dobili fragment velikosti 57 kDa, kar ustreza velikosti celotnega fuzijskega proteina (scFv-RFP). S tem so potrdili, da pride do ekspresije celotnega fuzijskega proteina. Analizirali so tudi vezavno kapaciteto izoliranega fuzijskega proteina s testom ELISA. Uporabili so različne koncentracije aflatoksina, kot izhodni signal so merili absorbanco pri 450 nm. Če bi bilo protitelo sposobno vezati aflatoksin, bi teoretično vrednosti OD morale naraščati z naraščajočo koncentracijo aflatoksina B1. Toda rezultati niso bili v skladu s pričakovanji, z naraščajočo koncentracijo aflatoksina se OD ni sorazmerno povečeval, ampak je pri najvišji konc. aflatoksina celo strmo padel. Iz takšnih rezultatov so zaključili, da fuzijski protein nima vezavne sposobnosti. S tehnologijo 3D tiskanja so oblikovali napravo iz polilaktata za pripravo vzorca in izolacijo aflatoksina. Sestavni deli naprave vključujejo 4 dele: pokrov,˝ mlinček˝(mesto, kamor bi vstavili vzorec hrane), mešalni tank in posoda s topilom. Ko bi se vzorec hrane in topilo dobro premešala, bi vstavili testni trak v odprtino na napravi in imunokromatografija bi se pričela.

Aplikacija

Z namenom, da bi zmanjšali uporabo testnih trakov, so oblikovali aplikacijo, ki detektira rezultat testa (slikanje testnega traku), omogoča prenos informacije o varnosti hrane v bazo podatkov (v oblaku), kjer se le ti skladiščijo in urejajo. Poleg tega omogoča tudi prenos informacij na spletno stran, ki bo dostopna proizvajalcem hrane. Na ta način bodo proizvajalci lahko kontinuirano spremljali, ali so njihovi produkti varni za uporabo oz. ali je prišlo do prijave okužbe z aflatoksinom. S pomočjo take aplikacije se bodo lahko hitreje odzvali na okužbo in jo pravočasno sanirali.

Viri

[1] http://2017.igem.org/Team:CSMU_NCHU_Taiwan

[2] M. C. Taylor et al.: Identification and characterization of two families of F420H2-dependent reductases from Mycobacteria that catalyse aflatoxin degradation. Molecular Microbiology. 2010, 78, 561–575

[3] S. Costa, A. Almeida, A. Castro, L. Domingues: Fusion tags for protein solubility, purification, and immunogenicity in Escherichia coli: The novel Fh8 system. Frontiers in Microbiology. 2014, 5, doi:10.3389/fmicb.2014.00063.

[4] https://en.wikipedia.org/wiki/Coenzyme_F420, 14.1.2018