Molekulsko kloniranje

Predmet 3. letnika študijskega programa Biokemija. Izvaja se v zimskem semestru. Ima 30 h predavanj, 5 h seminarjev in 40 h laboratorijskih vaj, skupaj 5 kreditnih točk ECTS.

Nosilec predmeta: izr. prof. dr. Marko Dolinar. V študijskem letu 2020/21 bodo predavanja potekala na spletu, medtem ko bodo vaje organizirane tako, da boste v laboratoriju izvedli približno pol običajnih eksperimentov, ostalo pa bo asistentka razložila na spletu. Skupine za vaje bodo pol manjše kot običajna leta.

Vaje so ključni del predmeta, zato jih vodi doc. Vera Župunski in je tudi delež vaj v skupni oceni predmeta ustrezno visok. Izpitni roki so trije (po en v vsakem izpitnem obdobju). Izpiti vključujejo snov predavanj in vaj. Za snov z vaj pisnemu delu sledi ustni del, ki ga opravite pri asistentki.

Teme predavanj

1. Kloniranje, pojem biološke varnosti in omejitve pri delu.
2. Zgodovina molekularne biotehnologije. Laboratorijski organizmi.
3. Encimi pri delu z DNA.
4. Elektroforezne metode.
5. Vektorske molekule. Reporterski geni.
6. Sinteza DNA in vitro. Sinteza cDNA. Priprava DNA-knjižnic. Transformiranje celic.
7. PCR in izvedene tehnike.
8. Hibridizacija, sonde, načini označevanja DNA. Presejanje knjižnic.
9. Določanje nukleotidnega zaporedja DNA (dideoksi-metoda).
10. Ekspresijski sistemi. Transkripcija/translacija in vitro.
11. Izražanje v prokariontih: vektorji, fuzije, optimizacija proizvodnje. Usmerjena lokalizacija, topnost, stabilnost, renaturacija.
12. Izražanje v kvasovkah, insektnih in sesalskih celicah.

Seminarji

Seminarji bodo vključeni v termine predavanj. Če bo čas, bomo obdelali nekatere ključne dosežke iz zgodovine molekulskega kloniranja. Posebna tema seminarjev - za delo doma - so ocene tveganja za delo z GSO. S temi seminarji dobite 7 % končne ocene predmeta.

Vsak študent bo dobil svojo kombinacijo gostiteljskega organizma, vektorja in vključka, svojo lokacijo predvidenega zaprtega sistema in namen dela. Na osnovi teh parametrov, ki jih boste dobili po e-pošti, ko zanje zaprosite, boste pripravili kratko oceno tveganja (predvidoma okrog 4 strani) in mi jo poslali po e-pošti.

V oceni tveganja (seminarju) označite z modro tiste dele, ki izhajajo iz predloge oz. ki so v pretežni meri prepisani od drugod. Z zeleno označite tiste dele, ki ste jih sestavili v sodelovanju s kolegi (spodaj navedite, kdo vse je sodeloval). Ni nujno, da npr. tisti, ki ste dobili enak gostiteljski organizem, skupaj sestavite en del ocene tveganja, lahko pa tako naredite. S črno pustite besedilo, ki je izključno vaše. Besedilo, pri katerem se sklicujete na nek vir, a ste ga napisali sami, naj bo napisano s črno, ne z modro.

Seminar mi lahko pošljete po e-pošti najkasneje tri dni pred izpitnim rokom. Oddan seminar je pogoj za pristop k izpitu. Oceno seminarja boste dobili skupaj z izpitno, če boste izpit opravili.

Vzorčna ocena tveganja je v spletni učilnici.

Teme laboratorijskih vaj

Navodila za vaje boste dobili pred začetkom vaj v formatu PDF. Teme vaj bodo:

1. Primerjava dveh metod za izolacijo plazmidne DNA, vloga dodatkov, agarozna elektroforeza.
2. Načrtovanje začetnih oligonukleotidov, konstruiranje rekombinantnih molekul (računalniška vaja).
3. Izolacija plazmidne DNA v srednjem merilu in ocena koncentracije.
4. Preparativno rezanje plazmidne DNA z restriktazami.
5. Izolacija DNA iz agaroznega gela.
6. Priprava kompetentnih celic.
7. Ligacija fragmentov DNA in transformacija bakterij. Analiza transformant.
8. Indukcija izražanja rekombinantne DNA.
9. Analiza topnosti rekombinantnega proteina. Lokalizacija rekombinantnega proteina in test biološke aktivnosti.

Vaje bodo dvakrat tedensko po 5 ur in bodo trajale 5 oz. 6 tednov. V vsaki skupini bo največ 10 študentov.

Izpitni roki

Izpitni roki v študijskem letu 2019/20 so bili:

• 12. februar 2020
• 22. junij 2020
• 20. avgust 2020

Ocenjevanje

Ocena je sestavljena iz 7 % za seminar, 10 % za poročila z vaj, 35 % za kolokvij z vaj in 48 % za teorijo. Izpit je pisni in ustni. Pogoj za opravljen izpit je, da ste bili na vseh vajah in ste oddali poročila z vaj, da ste na pisnem preverjanju znanja dosegli najmanj 50 % točk iz teorije in najmanj 40 % z vaj, da ste nato opravili ustni zagovor vaj in pripravili/oddali seminar.
Meje med ocenami bodo: do vključno 49 % 5, do 60 % 6, do 71 % 7, do 80 % 8, do 89 % 9, 90 % ali več 10. Če se kdo prijavi na izpit, pa se potem ne odjavi, ne vračam prijavnice, vas pa odjavim, če to odločitev sporočite do trenutka, ko dobite v roke izpitna vprašanja oziroma po e-pošti do razpisane ure izpita.
Ocena za vaje je sestavljena iz pisnega dela (pišete hkrati s teorijo) in iz ustnega dela. Vsak del šteje polovico tistega dela ocene, ki zajema znanje z vaj (35 % končne ocene).

Primeri sestavljanja ocene:

Prvi primer: Seminar 8, poročila z vaj 9, vprašanja z vaj 7 (pisno+ustno), teorija 57 %. Ocena se sestavi takole: 8*0,7 + 9*1 + 7*3,5 + 57*0,48 = 5,6 + 9 + 24,5 + 27,4 = 66,5, kar pomeni končno oceno 7.

Drugi primer (zelo dober študent): Seminar 9, poročila 10, vprašanja z vaj 9, teorija 89 %: seštevek točk je 6,3 + 9 + 31,1 + 42,7 = 89,1, ocena 9.

Tretji primer (manj uspešen študent): Seminar 5, poročila 7, vaje 5, teorija 50 %: seštevek točk je 3,5 + 7 + 17,5 + 24 = 52,0, ocena 6.

Popravljanje ocene:

Popravljanje ocene je možno samo s ponovnim pisanjem izpita in hkrati kolokvija. Velja boljša ocena. Za popravljanje se prijavite kot na redni rok. Če niste zadovoljni z oceno na pisnem delu izpita/kolokvija, vam ni treba priti na ustni del kolokvija. Lahko mi sporočite, da boste prišli popravljati oceno in v Studis vam bom vpisal oceno 5. Vendar v tem primeru tvegate, da morda tudi na naslednjem roku izpita ne opravite. Zato je bolj varno, da opravite tudi ustni del kolokvija in s tem zaključite rok.

Literatura

Twyman & Primrose: Principles of Gene Manipulation and Genomics. Oxford: Blackwell Publishing, 2006.