Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

Uvod

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

Pomen poznavanja genoma

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu. Mutacije virusov

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

Primerjava genomov med koronavirusi

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.)

Genom Koronavirusov

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice. Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

Bralni okvirji

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

Nestrukturni proteini

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov. Poznamo dva načina cepitve poliproteinov: V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici. Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini. Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze. Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu. Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

Strukturni N protein

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.