Vse v enem-IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v sesalskih celicah in tkivih

Uvod

Doslej razvita transgena stikala izkoriščajo zunanje dražljaje, ki jih lahko spreminjamo, kot so hormoni, kemikalije, težke kovine, toplota, svetloba ipd. Med genskimi stikali, ki so odvisni od majhnih molekul, je sistem Tet-On/Off (izkorišča tetraciklin ali njegove derivate, kot sta doksiciklin in minociklin) veljalo za najmočnejšo metodo za induciranje izražanja transgenov. Pogosto opažena nesprejemljiva stopnja pušččanja tega sistema poskušali so odpraviti z uporabo enovektorskega pristopa optimiziranega za proizvodnjo lentivirusa. Sistem 'vse v enem' Tet-Off je zmanjšal bazalno puščanje, vendar na račun moči indukcije transgena. Zaradi tega so razvili represibilni binarni transgenski indukcijski sistem, stikalo Q (ali SIQ), pridobljeno iz glive Neurospora crassa. SIQ ni pokazalo nobenega puščanja pri izražanju transgena v celicah sesalcev, hkrati pa je ohranjalo visoko občutljivost na kemični induktor [1], [2].

Za izdelavo novega SIQ so uporabljali vektor pENTR-EUI. Pred tem so dokazali, da je bilo singularno gensko stikalo (EUI) na osnovi Gal4/UAS uspešno implementirano za transgensko indukcijo v človeških celičnih linijah, vendar je transgenska inducibilnost sistema Gal4/UAS na splošno šibkejša ter je zelo občutljiv na metilacijo, kar lahko provzroči utišanje transgena po zaporednih generacijah. Na osnovi tega so za izdelavo novega sistema uporabili podoben vektor z uvedbo določenih sprememb, kot je recimo takoimenovani pogonski modul, ki je ključen za izražanje komponent potrebnih za vezavo na elemente ojačevalca 13 x QUAS, ki nato inducirajo transkripcijo transgena le, če ga stimulirajo kemični dražljaji. Končni vektor pSIQ je bil zasnovan tako, da izgubi tako pUC ori kot dva izbirna markerja po rekombinaciji z vektorjem pAd/PL-DEST za pripravo adenovirusa [1].

SIQ omogoča enostavno ustvarjanje stabilnih celičnih linij

Vektor pSIQ vsebuje prepoznavno meto serin integraze (phiC31) attB, ki omogoča generiranje stabilnih celičnih linij z rekombinacijo na osnovi integraze. V preskusni vektor so kot transgen vstavili zapis za EGFP, ki je odvisen od odmerka tebufenozida (Teb). S kontransfekcijo vektora pSIQ, ki kodira transgen EGFP, z ekspresijskim vektorjem integraze v HEK293-attP-Bla celicah so potrdili njihovo pravilno implantacijo na mesto attP gostiteljskega genoma. Potem so dokazali, da je raven izražanja EGFP naraščala z neprekinjenim dodajanjem Teb in je dosegla plato po 48 urah. Poleg tega vzpostavljena celična linija se je odzvala izključno na eksogene kemične dražljaje, kar so dokazali z opaženo postopno zmanjševanje ravni EGFP po odstranitvi Teb. Natančnost SIQ so dokazali tudi z generiranjem druge stabilne celične linije s istim transgenom in vsemi komponentami SIQ razen pogonskega modula (CMV-QFDBD-2x AD*-VP16*-EcR-poly(A)). Čeprav je prišlo do integracije na identičen attP lokus HEK293-attP-Bla celičnih linij, te brez pogonskega modula niso pokazale nobenega odziva na dražljaje z uporabo Teb. Pomembno je omeniti tudi to, da je SIQ-EGFP brez dodajanja Teb prikazala le zanemarljivo raven izražanja EGFP [1], [3], [4].

Preklopno stikalo SIQ lahko preuredimo v sistem za dostavo genov posredovani z adenovirusi

Sistemi za dostavo genov, posredovani z adenovirusi, so bili v veliki meri uporabljeni za klinične aplikacije. Glavna pomanjkljivost virusnega vektorja je to, da kaže sposobnost okužbe širokega sprektra celičnih linij. Poleg tega narava adenovirusa je taka, da ne pride do integracije v genom gostiteljskega organizma, kar sčasoma privede do zmanjševanja ravni virusnega genoma v celicah. Da bi olajšali učinkovito dostavo pSIQ v celice, ki kažejo zelo nizko učinkovitost transfekcije, so uporabili adenovirusni pakirni sistem. Vektor pSIQ z EGFP so in vitro integrirali z vektorjem pAd/PL-DEST. Poleg tega pripravili so tudi adenovirusni vektor pENTR-EUI, ki se odziva na Teb. pENTR-EUI, ki nosi zapis za EGFP, je bil uporabljen za proizvodnjo adenovirusa (Ad/EUI-EGFP) po združitvi s vektorjem pAd/PL-DEST. Izražanje EGFP v pENTR-EUI je bilo kontrolirano z sistemom Gal4/UAS, kar je služilo kot kontrola za primerjavo sistema SIQ. Po različnih eksperimentih so dokazali, da je bil potreben vsaj 10x višji MOI (razmerje med številom transducirajočih vektorjev in številom celic) Ad/EUI-EGFP, da bi dosegli enakovreden odziv celic, okuženih z Ad/SQI-EGFP[5]. Poročali so, da je intravensko injiciran adenovirus zelo nalezljiv za jetra, kamor virus najprej pride preko jetrne vene in se infiltrira v jetrne celice [6]. Da bi preverili ali je Ad/SIQ-EGFP, ki so ga uporabljali za okužbo keratinocitov HaCaT, uporaben tudi v raziskavah in vivo, so v repno veno miši injicirali 100 µL adenovirusa s povečano koncentracijo virusnih delcev. Po 24 urah okužbe z Ad/SIQ-EGFP so enkrat dnevno v 24-urnih intervalih z intraperitonealno injekcijo vbrizgali 100 µL PBS ali enako količino Teb (1mmol/L) raztopljenega v PBS. En dan po injiciranju kemičnega dražljaja so eviscerirali jetra, da bi preverili izražanje EGFP. Kot je bilo pričakovano samo pri jetrih, ki so bila okužena z virusom so pokazale pozitiven odziv na Teb za razliko od jeter, ki niso bila okužena. Še pomembnejše je bilo opažanje, da okužba z virusom v odsotnosti zdravljenja s Teb ni provzročila nobene zaznavne ekspresije EGFP. Pomembno je omeniti tudi to, da pri miših z virusno okužbo z uporabo Ad/SIQ-EGFP niso odkrili nobenih opaznih okvar jeter, niti po dolgotrajnem rednem dajanju Teb 3 tedne. Treba je omeniti, da preklopno stikalo SIQ presega sistem EUI, ki temelji na Gal4/UAS, in je primerljiv s konstitutivnim ekspresijskim sistemom, ki izhaja iz CMV in vivo [7].

Sofisticirano transgensko preklapljanje lahko dosežemo s kombinacijo SIQ in genskega stikala cumate

Čeprav je SIQ pokazal svojo visoko vsestranskost v celičnih linijah, pridobljenih iz človeka, obstaja proctor za izboljšave z vključitvijo drugih genskih regulacijskih elementov, ki jih je mogoče nadzorovati z drugimi kemičnimi ligandi. To vključuje recimo razvoj ortogonalnega genskega stikala, kjer lahko dva ali več različnih induktorjev uravnava izražanje transgena, ne da bi se med seboj motili. Na splošno kemičnih genskih stikal ni mogoče na hitro izklopiti zaradi dolgotrajnih učinkov kemičnih induktorjev na transgen. Da bi dosegli pospešeno supresijo ekspresije tarčnega gena, so v preklopno stikalo SIQ uvedli od kumata odvisen transgenski represor [8]. Gensko stikalo na osnovi kumata je sestavljeno iz dveh glavnih komponent: represorskega modula CymR in zaporedja CuO, na katero se veže CymR in inhibira ekspresijo transgena. Kumat (4-izopropilbenzojska kislina) se neposredno veže na CymR in ga loči od CuO, kar provzroči derepresijo transgenske ekspresije. Golnilno zaporedje pSIQ so povezali s CymR preko zaporedja peptida 2A P2A ter so CuO, dolžine 28 baznih parvov, dodali neposredno pred mestom začetka transkripcije transgena pSIQ. Takšna ureditev omogoča hkratno izražanje gonilnega zaporedja SIQ in represorja CymR. Ta konstrukt imenovali so pSIQmate, ki je bil sestavljen iz 9001 nukleotida. Da bi preizkusili odzivnost SIQmate na oba induktorja, so začasno transficirali celice HEK293 z pSIQmate-EGFP in jih nato obdelali s Teb ali kumatom posamično, pa tudi v kombinaciji. Rezultati obdelave celic so pokazali, da je prišlo do florescence EGFP samo v primerih uporabe obeh kemikalij sočasno. Poleg tega pokazalo se je, da so kloni, ki so bili obdelani samo s Teb, pokazali obrobno povišanje fluorescenčnih signalov. Ti signali niso bili dovolj močni, da bi jih lahko zaznali s fluorescenčno mikroskopijo in so zaradi tega naredili ponovno kvantifikacijo ampak z merjenjem aktivnosti luciferaze. Ta pojav je verjetno posledica občasnega odvajanja CymR od CuO ne glede na kumat, kar je pogost pojav med regulatorji transkripcije [9]. Po ponovni kvantifikaciji z merjenjem aktivnosti luciferaze, je SIQmate pokazal znatno nižjo občutljivost na kemične dražljaje v primerjavi s SIQ (približno 0,2-kratna razlika). Iz the razlogov obstaja možnost potrebe nadaljnje optimizacije za povečanje robustnosti transgenske aktivacije v sistemu SIQmate.

Zaključek

Obstaja več meril, ki jih je treba upoštevati, preden se oblikuje novo, kemično zasnovano transgensko preklopno stikalo. Vsak sistem za regulacijo transgenov ne sme biti toksičen za celice in organizme, mora biti izjemno občutljiv in natančno moduliran s pravilnim odmerkom spojin, ki delujejo kot kemični dražljaji. Usodna napaka binarne lasnosti transgenskih preklopnih stikal je, da je težko pričakovati, da bo dosegla enakomerno dostavo dveh ločenih vektorjev v ciljne celice in tkiva hkrati. Posledica tega je nastajajoča populacija celic z neenakomerno porazdeljenimi plazmidi. Čeprav se lahko raziskovalci izognejo proizvodnji neželene heterogene populacije celic z vzpostavitvijo stabilne celične linije, je to naporen in dolgotrajen proces [10]. Zato bi bila izdelava zanesljivega in vsestranskega singularnega transgenskega stikala zaželena na področju predkliničnih in bioloških raziskav. Dokazali so, da je preklopno stikalo SIQ boljše od EUI Sistema na osnovi Gal4/UAS v smislu večje občutljivosti na kemične dražljaje, nižje bazalne ekspresije in večje vsestranskosti. Takšen sistem najde široko uporabo, vključno s poskusi prehodne transfekcije, vzpostavitvijo stabilnih celičnih linij in proizvodnjo adenovirusa, pri čemer je za vse potreben le en krog subkloniranja transgenov v pSIQ.

Literatura

[1] J. Hong et al., “All-in-one IQ toggle switches with high versatilities for fine-tuning of transgene expression in mammalian cells and tissues,” Mol Ther Methods Clin Dev, vol. 32, no. 1, p. 101202, Mar. 2024, doi: 10.1016/j.omtm.2024.101202.

[2] E. Vigna et al., “Robust and Efficient Regulation of Transgene Expression in Vivo by Improved Tetracycline-Dependent Lentiviral Vectors,” Molecular Therapy, vol. 5, no. 3, pp. 252–261, Mar. 2002, doi: 10.1006/mthe.2002.0542.

[3] C.-A. Lo, A. W. Greben, and B. E. Chen, “Generating stable cell lines with quantifiable protein production using CRISPR/Cas9-mediated knock-in,” Biotechniques, vol. 62, no. 4, pp. 165–174, Apr. 2017, doi: 10.2144/000114534.

[4] C. A. Merrick, J. Zhao, and S. J. Rosser, “Serine Integrases: Advancing Synthetic Biology,” ACS Synth Biol, vol. 7, no. 2, pp. 299–310, Feb. 2018, doi: 10.1021/acssynbio.7b00308.

[5] J. T. Bulcha, Y. Wang, H. Ma, P. W. L. Tai, and G. Gao, “Viral vector platforms within the gene therapy landscape,” Signal Transduct Target Ther, vol. 6, no. 1, p. 53, Feb. 2021, doi: 10.1038/s41392-021-00487-6.

[6] S. J. Duncan et al., “Infection of Mouse Liver by Human Adenovirus Type 5,” Journal of General Virology, vol. 40, no. 1, pp. 45–61, Jul. 1978, doi: 10.1099/0022-1317-40-1-45.

[7] S. Lee et al., “Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switches for Regulated Transgene Expression in Cells and Adult Rodent Tissues,” Mol Ther Nucleic Acids, vol. 5, p. e367, 2016, doi: 10.1038/mtna.2016.74.

[8] A. Mullick et al., “The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells,” BMC Biotechnol, vol. 6, no. 1, p. 43, 2006, doi: 10.1186/1472-6750-6-43.

[9] A. Raj and A. van Oudenaarden, “Nature, Nurture, or Chance: Stochastic Gene Expression and Its Consequences,” Cell, vol. 135, no. 2, pp. 216–226, Oct. 2008, doi: 10.1016/j.cell.2008.09.050.

[10] Y. Suzuki and Y. Suzuki, “Gene Regulatable Lentiviral Vector System,” in Viral Gene Therapy, InTech, 2011. doi: 10.5772/18155.